1、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，Ab）可引起尿道感染、皮膚軟組織感染、菌血癥、腦膜炎、肺炎等多種感染性疾病，其中以耐碳青霉烯類Ab為代表的耐藥菌感染引起的肺炎和膿毒血癥可引發(fā)較高的死亡率。近年來，隨著抗生素大量的不合理使用，催生出了一系列多重耐藥鮑曼不動桿菌（Multi-drug resistance Acinetobacterbaumannii，MDR-AB），泛耐藥鮑曼不動桿菌（Pan-drug res

2、istant Acinetobacterbaumannii PDR-AB）。多種抗生素的聯(lián)用已經(jīng)無法有效控制鮑曼不動桿菌的感染。因此，為應(yīng)對鮑曼不動桿菌緊迫而嚴(yán)重的耐藥威脅，迫切需要研發(fā)新型抗生素、疫苗和其他治療策略。
　　目的:為了評價(jià)A1S_1969蛋白的免疫原性和免疫保護(hù)性，探討其作為鮑曼不動桿菌基因工程亞單位疫苗候選抗原的可能性，本課題在對A1S_1969進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，確定A1S_1969蛋白的α螺旋區(qū)域（A

3、1S_1969α）作為本疫苗的候選抗原及研究靶點(diǎn)，通過基因工程技術(shù)對其進(jìn)行基因克隆和蛋白表達(dá)。在制備高純度可溶性A1S_1969α重組蛋白的基礎(chǔ)上，采用建立的小鼠全身感染模型對該重組蛋白的免疫原性和免疫保護(hù)性進(jìn)行初步評價(jià)。以期為新型、有效的鮑曼不動桿菌疫苗的分子設(shè)計(jì)、抗原選擇，以及后續(xù)重組亞單位/多亞單位鮑曼不動桿菌疫苗的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。
　　方法:1.利用Blast對A1S_1969基因的保守性進(jìn)行分析，PCR檢測4

4、5株臨床分離菌株中A1S_1969基因序列的保守性。SingalP-4.1和TMHMM在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，SWISS-MODEL在線軟件進(jìn)行同源建模分析，對A1S_1969編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　2.培養(yǎng)鮑曼不動桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC_17978，提取ATCC_17978基因組作為模板，通過PCR擴(kuò)增A1S_1969α目的基因片段，經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ兩種限制性內(nèi)切酶處理后導(dǎo)入PGEX-6p-2表達(dá)載體，再將

5、該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌XL1-Blue，構(gòu)建PGEX-6p-2-A1S_1969α/XL1-Blue基因工程菌株。
　　3.利用IPTG對PGEX-6p-2-A1S_1969α/XL1-Blue基因工程菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，采用Glutathione Sepharose4B親和層析提取GST-A1S_1969α融合蛋白，通過Prescission Protease酶切去除GST標(biāo)簽后獲得A1S_1969α粗純蛋白，經(jīng)G25柱、Q

6、HP柱置換緩沖液和去內(nèi)毒素獲得精純重組蛋白。采用HPLC、BCA法和鱟試劑法分別檢測重組蛋白的純度、濃度和內(nèi)毒素;采用MS質(zhì)譜檢測A1S_1969α重組蛋白N-端氨基酸殘基、毛細(xì)管電泳測定蛋白相對分子量，驗(yàn)證A1S_1969α重組蛋白的正確性。
　　4.通過培養(yǎng)ATCC17978菌株并繪制生長曲線，采用對數(shù)生長期細(xì)菌對BALB/c小鼠進(jìn)行腹腔攻毒感染，摸索不同細(xì)菌濃度的感染劑量，建立全身感染/致死模型。采用2.5×108CFU/只

7、(LD50)感染BALB/c小鼠，在不同時(shí)間點(diǎn)動態(tài)監(jiān)測感染小鼠血液、肝臟、腎臟、脾臟和肺部的細(xì)菌定植量、血清炎癥因子水平、各臟器病理改變、感染小鼠狀態(tài)主觀評分，對鮑曼不動桿菌BALB/c小鼠全身感染模型進(jìn)行系統(tǒng)評價(jià)。
　　5.采用氫氧化鋁佐劑吸附A1S_1969α重組蛋白，按0天、7天、14天免疫程序免疫BALB/c小鼠，動態(tài)監(jiān)測各針次免疫小鼠后血清中特異性抗體水平，繪制免疫后63天內(nèi)（每間隔3天取血）抗體消長曲線，并對抗體亞型進(jìn)

8、行檢測分析。評價(jià)A1S_1969α重組蛋白的免疫原性和免疫持久性。
　　6.設(shè)計(jì)4種免疫劑量對BALB/c小鼠進(jìn)行免疫接種，采用4.2×108CFU/只(LD80)對免疫后BALB/c小鼠進(jìn)行攻毒感染，分別檢測各劑量組感染小鼠的血液細(xì)菌定植量、小鼠血清炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和小鼠生存率，評價(jià)各免疫劑量組的免疫保護(hù)性，優(yōu)選出適宜的免疫劑量。
　　結(jié)果:1.生物信息學(xué)分析A1S_1969基因在Ab菌株的序列

9、一致性高達(dá)98％，通過PCR檢測45株國內(nèi)Ab臨床分離菌株中的A1S_1969基因擴(kuò)增陽性率為83％，表明A1S_1969基因序列高度保守。亞細(xì)胞定位分析顯示:在該基因編碼蛋白N-端含有43個(gè)氨基序列長度的信號肽分子，序列均在膜外區(qū)。蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)預(yù)測分析顯示:A1S_1969與外膜蛋白BamA具有38.42％相似度。綜合分析預(yù)測A1S_1969為鮑曼不動桿菌的外膜蛋白。
　　2.成功擴(kuò)增了A1S_1969α目的基因片段，分子

10、量大小為1107bp(136～1242bp)，成功克隆構(gòu)建了pGEX-6p-2-A1S_1969α/XL1-Blue重組基因工程菌株，經(jīng)酶切鑒定重組質(zhì)粒及測序分析表明，與理論設(shè)計(jì)完全一致，A1S_1969α重組基因工程菌株構(gòu)建成功。
　　3.不同溫度下對pGEX-6p-2-A1S_1969α/XL1-Blue重組基因工程菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示:30℃下IPTG誘導(dǎo)3h獲得高表達(dá)GST-A1S_1969α融合蛋

11、白;分級純化后獲得的A1S1969α重組蛋白純度大于95％，內(nèi)毒素含量合格(小于10EU/mg)，重組蛋白N-端氨基酸殘基序列為:NH2-Gly-Pro-Leu-Gly-Ser-Asp-Phe-Val-Val-Arg-Asp-Ile-Arg-Val-Asn，相對分子量為42.233kD，與理論完全一致。
　　4.37℃培養(yǎng)鮑曼不動桿菌ATCC17978菌株，測定不同時(shí)間下菌液吸光度值并繪制細(xì)菌生長曲線，5～8h期間細(xì)菌生長最為迅速

12、，為對數(shù)生長期;摸索出各細(xì)菌感染濃度下BALB/c小鼠的死亡率，亞致死劑量為2.0×109 CFU/只，LD50劑量為2.5×108CFU/只，LD70劑量，3.0×108CFU/只，LD80劑量為4.0～5.0×108CFU/只，LD100劑量為6.0×108CFU/只，12h～16h為感染小鼠死亡高峰期。LD50劑量感染小鼠后6～12h期間小鼠血液、各臟器細(xì)菌負(fù)荷量達(dá)到高峰，24h后各臟器內(nèi)Ab基本被機(jī)體清除;感染后6h～12h小鼠

13、血清中IL-1β、IL-6和TNF-α炎癥因子水平較高;觀察感染12h后小鼠肺、肝臟、腎臟HE染色病理切片顯示:感染12h后各臟器出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，隨著感染時(shí)間的延遲炎性細(xì)胞浸潤增強(qiáng)，感染48h后各臟器均出現(xiàn)明顯的病理損壞。觀察感染小鼠狀態(tài)發(fā)現(xiàn):小鼠感染后第3h產(chǎn)生高熱、背毛聳立、活動度減少，感染第6h后小鼠活動度進(jìn)一步減少、大小便失禁，感染12h后小鼠體溫降低開始出現(xiàn)死亡，感染第24h小鼠活動度增加開始進(jìn)食。
　　5.連續(xù)檢測A

14、1S_1969α免疫后小鼠血清中IgG特異性抗體水平顯示:A1S_1969α重組蛋白可刺激小鼠產(chǎn)生高滴度特異性IgG抗體，在末次后第28天IgG幾何平均滴度達(dá)到7.0×105，并且抗體滴度能長時(shí)間維持在一個(gè)較高的水平。通過抗體亞型檢測分析顯示:A1S_1969α特異性IgG抗體亞型以IgG1為主。
　　6.4種免疫劑量的小鼠免疫攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:感染小鼠后，與對照組相比較，小鼠血液中荷菌量明顯高于30μg組(p＜0.05)、60μ

15、g組(p＜0.01)和120μg組(p＜0.01)，對照組與15μg組無明顯差異;60μg組和120μg組小鼠血清炎癥因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)明顯低于對照組，60μg組(p＜0.01)，120μg(p＜0.01);60μg組和120μg組免疫小鼠與對照組相比較可明顯提高小鼠生存率，60μg組小鼠生存率為70％(p＜0.05)，120μg組小鼠生存率為80％(p＜0.01)，最終優(yōu)選出120μg為適宜免疫劑量組。
　

16、　7.體外中性粒細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:小鼠源性和兔源性A1S1969α特異性IgG抗體介導(dǎo)中性粒細(xì)胞對ATCC17978菌株的吞噬率分別為58.68％和70.09％，與陰性對照組具有顯著性差異(p＜0.01)。體內(nèi)的被動免疫攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:免疫組小鼠血液、各臟器中荷菌量明顯低于陰性對照組，具有顯著性差異(p＜0.01);免疫組小鼠血清炎癥因子水平（IL-1β、IL-6和TNF-α）明顯低于對照組小鼠(p＜0.01);免疫組小鼠生存

17、率為90％，顯著高于陰性對照組(p＜0.01)。
　　結(jié)論:1.通過基因工程技術(shù)成功構(gòu)建pGEX-6p-2-A1S_1969α/XL-1Blue重組表達(dá)工程菌株，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和多級純化后獲得高純度的可溶性A1S_1969α重組蛋白，經(jīng)HPLC、N-端氨基酸測序、分子量測定等質(zhì)量檢定，A1S_1969α與理論完全相符，達(dá)到疫苗抗原的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。
　　2.通過腹腔攻毒感染途徑明確了感染劑量，建立了穩(wěn)定可靠的鮑曼不動桿菌小鼠全身感

18、染/致死模型，為后續(xù)篩選和鑒定鮑曼不動桿菌免疫優(yōu)勢抗原奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　3.A1S_1969α重組蛋白動物主動免疫和被動免疫攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，A1S_1969α免疫機(jī)體后可激發(fā)高效的保護(hù)性免疫應(yīng)答，促進(jìn)機(jī)體對鮑曼不動桿菌的清除，抑制炎因子的表達(dá)，抑制鮑曼不動桿菌感染所引起的病理損傷，并顯著提高了小鼠生存率，具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性。
　　4.本課題首次克隆表達(dá)并成功制備了A1S_1969α重組蛋白，證實(shí)其