1、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者。近年來(lái)，絲裂原活化蛋白激酶的研究，使人們對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。多種細(xì)胞生理過(guò)程，如生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、死亡以及細(xì)胞間的功能同步化等都涉及到MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。從單細(xì)胞酵母到人類都保留了保守的MAPK激酶級(jí)聯(lián)通路，即MAPKKK(MAPkinasekinasekinase)→MAPKK(MAPkinasekinase)→MAPK(

2、MAPkinase)。外界因素刺激引起MAPKKK磷酸化激活，然后MAPKKK磷酸化激活MAPKK，繼而激活MAPK。 STE20是釀酒酵母的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，位于MAPK級(jí)聯(lián)通路的上游。該家族包括PAK和SPS1兩個(gè)亞族。mst3是哺乳動(dòng)物STE20絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，1997年首次從hela細(xì)胞cDNA文庫(kù)中分離出來(lái)，屬于SPS1亞族，包含一個(gè)N端催化功能區(qū)和一個(gè)C端調(diào)節(jié)功能區(qū)。目前已知caspase酶切

3、激活mst3后促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但其他生理機(jī)能是未知的。本研究對(duì)mst3在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)及其作用機(jī)制進(jìn)行探索性研究，為今后的研究奠定理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依掘，具體內(nèi)容包括： 一、mst3-pCMV-tag3c重組質(zhì)粒的構(gòu)建和mst3碳端抗體特異性的檢測(cè)鑒定用EcoRI和ApaI限制性內(nèi)切酶從mst3-pCDNA3.0'上切取1230bp的mst3cDNA片斷。按pCMV-tag3c載體的多克隆位點(diǎn)用EcoRI和ApaI限制性內(nèi)

4、切酶切開pCMV-tag3c載體。pCMV-tag3c和mst3的酶切片斷16℃經(jīng)T4連接酶作用形成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)限制性酶切進(jìn)行鑒定并進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。結(jié)果表明：成功克隆到mst3全編碼基因片斷，序列與GenBank中收錄的mst3cDNA序列一致。mst3-pCMV-tag3c重組質(zhì)粒在LipofectAMINETM2000脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T，通過(guò)免疫熒光共定位

5、方法鑒定mst3碳端抗體的特異性。 二、mst3特異性在小鼠胚胎骨骼肌組織表達(dá)，表達(dá)具有時(shí)空差異性利用光鏡免疫組織化學(xué)方法對(duì)小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中mst3的組織表達(dá)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，結(jié)果表明：1.mst3在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中的組織分布非常特異：特異地在胚胎的骨骼肌組織表達(dá)。2.mst3在骨骼肌的表達(dá)存在一定的時(shí)空差異性。mst3在胚胎第10.5d開始在胚胎表達(dá)，僅特異性地表達(dá)于肌節(jié)，在肢芽未見表達(dá)。胚胎第11.5d，mst3開始在前肢

6、芽表達(dá)，后肢芽未見表達(dá)。胚胎第12.5d，mst3開始在顱面和后肢芽表達(dá)，在前肢芽的背腹部肌肉團(tuán)表達(dá)。胚胎第13.5d，mst3在初次形成的初級(jí)肌管表達(dá)。胚胎第16.5d，mst3在初次形成的次級(jí)肌管表達(dá)。 三、BrdU增生染色和TUNEL凋亡染色初步探討mst3在胚胎骨骼肌發(fā)育過(guò)程中的可能機(jī)制應(yīng)用免疫組化方法連續(xù)切片和激光共聚焦技術(shù)觀察胚胎第10.5dmst3的表達(dá)與細(xì)胞增生，同時(shí)也應(yīng)用免疫組化方法連續(xù)切片觀察胚胎第10.5

7、d和第11.5dmst3的表達(dá)和細(xì)胞凋亡的關(guān)系，激光共聚焦技術(shù)觀察胚胎第11.5dmst3的表達(dá)和細(xì)胞凋亡的關(guān)系，以探討mst3在胚胎第10.5d的表達(dá)是否通過(guò)促進(jìn)或抑制細(xì)胞增生和凋亡在小鼠胚胎骨骼肌發(fā)育中起作用。結(jié)果表明：mst3的表達(dá)與細(xì)胞增生和凋亡沒(méi)有顯著相關(guān)性，可能通過(guò)別的機(jī)制調(diào)控骨骼肌發(fā)育。 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們得出以下結(jié)論：mst3與小鼠胚胎骨骼肌發(fā)育密切相關(guān)。mst3從胚胎發(fā)育早期開始就特異性表達(dá)于肌節(jié)，在骨骼