1、本研究利用單點(diǎn)突變和疊加突變技術(shù)手段，對(duì)擴(kuò)展青霉脂肪酶(PEL)進(jìn)行熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)工程改造。ep8是由本課題組獲得的含有一個(gè)突變點(diǎn)的隨機(jī)突變熱穩(wěn)定性脂肪酶，在利用PCR介導(dǎo)的分子克隆技術(shù)構(gòu)建pSK-ep8 模板后，采用重疊延伸PCR的方法構(gòu)建了PEL-ep8-K115R、PEL-ep8-K55R、PEL-ep8-E214P、PEL-ep8-S104V、PEL-ep8-S139V、PEL-ep8-N166E、PEL-ep8-G205P、

2、PEL-ep8-A170P、PEL-ep8-A144P、PEL-ep8-A105P等10個(gè)疊加突變體，將上述突變基因在畢赤酵母GS115中表達(dá)，獲得了10種含有突變基因的產(chǎn)脂肪酶工程菌。發(fā)酵獲得突變酶并進(jìn)行了其穩(wěn)定性的研究。 本研究共獲得了3株熱穩(wěn)定性有所改善的疊加突變脂肪酶，一株為最適作用溫度下降5℃，同時(shí)熱穩(wěn)定性Tm值分別比野生型和隨機(jī)突變酶提高3.5℃和2.0℃的熱穩(wěn)定性低溫酶PEL-ep8-K115R-GS，其發(fā)酵酶活為

3、696U/mL，表達(dá)量為480ug/mL，比活為1449.0U/mg。一株為Tm值分別比野生型和隨機(jī)突變酶提高4.5℃和3.2℃的熱穩(wěn)定性酶PEL-ep8-E214P-GS，其發(fā)酵酶活為645U/mL，表達(dá)量為220ug/mL，比活為2931.8U/mg。一株為熱穩(wěn)定性Tm值比野生型酶提高2.3℃，且與隨機(jī)突變酶相仿的熱穩(wěn)定性酶PEL-ep8-K55R-GS，發(fā)酵酶活為508U/mL，表達(dá)量為220ug/mL，比活為2309.1U/mg

4、。 本研究還獲得了7個(gè)疊加突變脂肪酶，它們的熱穩(wěn)定性沒(méi)有明顯的改善，有的甚至由于突變對(duì)空間構(gòu)象的巨大影響而使突變酶失去了絕大部分活性。疊加突變酶PEL-ep8-N166E-GS，其Tm值為37.9℃，與野生型的相仿；疊加突變酶PEL-ep8-S104V-GS，其Tm值為39.1℃，比野生型下降1.6℃；疊加突變酶PEL-ep8-S139V-GS，其Tm值為35.7℃，比野生型下降5.4℃。還有疊加突變酶PEL-ep8-G205P