1、目的:
　　通過觀察重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)模型大鼠腸組織中緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1和分泌型磷脂酶A2(secretedphospholipaseA2，sPLA2)表達的變化規(guī)律，來探討重癥急性胰腺炎時，因上皮細胞凋亡和緊密連接斷裂引起腸道機械屏障損傷的發(fā)生發(fā)展與分泌型磷脂酶A2、緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1的關系，分析肌球蛋白輕鏈激酶(myosi

2、n light chain kinase，MLCK)對緊密連接蛋白的調控通路在腸黏膜機械屏障中的作用，從而進一步探究重癥急性胰腺炎時腸道屏障功能損傷的發(fā)病機理，探討中醫(yī)通里攻下理論在重癥急性胰腺炎時腸道屏障功能損傷發(fā)病機制中的作用，同時觀察祖國傳統(tǒng)中藥清胰湯(Qingyitang)、臨床常規(guī)抗炎藥物地塞米松(Dexamethasone)、MLCK抑制劑ML-7和樹突細胞(dendritic cells，DC)對腸黏膜上皮細胞凋亡、緊密連

3、接結構變化、炎癥因子表達水平的影響，探討中藥清胰湯對重癥急性胰腺炎相關腸道機械屏障損傷的保護作用，為臨床工作中有效提高重癥急性胰腺炎及其腸道損傷的治療效果提供理論指導和實驗依據。
　　方法:
　　實驗一:采用經十二指腸大乳頭開口處沿膽胰管內逆行注射1.5％去氧膽酸鈉模擬膽源性胰腺炎的方法建立SAP大鼠模型。128只體質量為180～220g健康雄性SPF級(Spraghe-Dawley，SD)大鼠，隨機分為4組:假手術(sha

4、m operation，SO)組、重癥急性胰腺炎(SAP)模型組、清胰湯(Qingyitang，QYT)干預組、地塞米松(Dexamethasone，DEX)干預組。其中，SO組僅在打開腹腔后輕翻胰腺1～2次后關腹，SAP模型組采用去氧膽酸鈉膽胰管內逆行注射建立SAP大鼠模型，QYT干預組在制備SAP大鼠模型前0.5h、后6h和12h給予中藥制劑清胰湯灌胃，DEX干預組在制備SAP大鼠模型后立即、后6h和12h經尾靜脈注射地塞米松進行干

5、預，地塞米松給藥劑量:10mg/kg，濃度:5mg/ml。各組實驗動物造模后2h、6h、12h、24h每一時間點每組隨機選取8只大鼠，用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，留取血液和組織標本，觀察胰腺和腸組織病理改變，上皮細胞間緊密連接變化情況，測定血清淀粉酶、內毒素、TNF-α的含量。在造模24h后應用TUNEL-FITC法檢測大鼠腸黏膜上皮細胞凋亡情況，應用Real-time PCR法檢測大鼠腸黏膜緊密連接蛋白Occludin-1 mRNA

6、、ZO-1mRNA和sPLA2mRNA基因表達。應用Westernblot法檢測腸組織中緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1和sPLA2的表達。
　　實驗二:分為動物模型和細胞實驗兩部分。動物模型部分，48只健康雄性SPF級SD大鼠，隨機分為:假手術組、模型組、清胰湯干預組和肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑ML-7（劑量:1mg/kg，濃度:1mg/ml）干預組。各組大鼠造模24 h后麻醉，留取血液和組織標本，應用ELISA法（酶聯(lián)免

7、疫吸附測定法）檢測大鼠血清中內毒素、TNF-α等含量，應用免疫熒光法定位檢測腸黏膜緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1和肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的表達，應用Western blot法檢測腸黏膜上皮細胞緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1和肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的表達水平。細胞實驗部分，選用人腸黏膜上皮細胞株Caco2，以100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml的不同濃度脂多糖(LPS)刺激腸

8、黏膜上皮細胞，制備腸黏膜上細胞損傷模型，并于刺激后48h檢測炎癥因子表達水平，應用Western blot法檢測腸黏膜上皮細胞緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1和肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的表達水平，并最終選取1μg/ml LPS刺激48h后的上皮細胞為損傷模型，設立空白對照組，采用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測腸黏膜上皮細胞骨架結構變化，同時觀察中藥單體大黃素(40μM)和肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑ML-7(10μM)的干預作用。

9、r>　　實驗三:采用LPS刺激人腸黏膜上皮Caco2細胞株，建立腸黏膜上皮細胞損傷模型，分為空白對照組、LPS刺激組、10％樹突細胞干預組（樹突細胞與Caco2細胞共培養(yǎng)比值為1∶10）、5％樹突細胞干預組（樹突細胞與Caco2細胞共培養(yǎng)比值為1∶20）、2.5％樹突細胞干預組（樹突細胞與Caco2細胞共培養(yǎng)比值為1∶40）。造模48h后，應用液相芯片法檢測炎癥因子表達水平，應用Western blot法檢測腸黏膜上皮細胞緊密連接蛋白O

10、ccludin-1、ZO-1和肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的表達水平，采用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測腸黏膜上皮細胞骨架結構變化，分析樹突細胞的干預作用。
　　結果:
　　(1)對比假手術組，SAP模型組大鼠血清內毒素、TNF-α和淀粉酶含量、腸組織中sPLA2、 MLCK蛋白含量均明顯增高，腸組織中緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1含量明顯減少，胰、腸組織出現(xiàn)明顯損傷，腸黏膜上皮細胞間緊密連接間隙增寬，腸黏膜上皮細胞凋

11、亡量升高(P＜0.01)。對比SAP模型組，清胰湯、地塞米松、ML-7三組藥物干預后的大鼠血清內毒素、TNF-α、淀粉酶含量、腸組織中sPLA2、 MLCK蛋白含量均明顯減少，腸組織中緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1含量明顯增高，胰、腸病理損傷較輕，腸黏膜上皮細胞間緊密連接結構損傷減輕，腸黏膜上皮細胞凋亡相對減少，具有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(2)與對照組相比，LPS刺激組Caco2細胞MLCK含量明顯增

12、高(P＜0.05)，細胞間緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1含量明顯減少(P＜0.05)，細胞骨架結構損傷明顯，以LPS刺激48h后的腸黏膜上皮細胞損傷最為顯著。與LPS刺激組相比，ML-7干預組Caco2細胞MLCK含量明顯減少（P＜0.05），細胞間緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1含量明顯增加（P＜0.05）;大黃素干預組炎癥因子IL-1β、IFN-γ表達明顯減少，細胞骨架結構損傷減輕，但緊密連結蛋白含量較LPS刺

13、激組并無明顯改變。與LPS刺激組相比，10％樹突細胞干預組Caco2細胞間緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1含量明顯增加(P＜0.05)，MLCK含量明顯減少(P＜0.05)。
　　結論:
　　(1)在膽胰管內逆行注射去氧膽酸鈉溶液制備膽源性重癥急性胰腺炎大鼠腸道屏障損傷模型穩(wěn)定，模型組大鼠血清內毒素、TNF-α等炎癥因子含量在短時間內(2h)顯著升高，胰腺和腸組織發(fā)生明顯損傷。
　　(2)SAP時，腸組織中s

14、PLA2表達增高，促進腸黏膜上皮細胞凋亡，在腸黏膜機械屏障損傷中起重要作用。
　　(3)SAP時，高表達的MLCK下調緊密連接蛋白Occludin-1、ZO-1的表達，導致緊密連接間隙增寬，在腸黏膜機械屏障損傷中均起重要作用。
　　(4)地塞米松可以抑制血清內毒素、TNF-α的過量表達。ML-7能抑制MLCK的過度表達。清胰湯可以通過促進腸蠕動、降低腸道通透性、減少腸道內細菌移位的作用，防治SAP相關腸道屏障損傷，其可以和西