1、目的：EMS1基因是一種癌基因，首先從乳腺癌和頭頸部鱗癌中被克隆出來而被人們所認知。本課題組前期發(fā)現(xiàn)EMS1基因為胃癌相關(guān)基因，在胃癌中高表達，與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究表明，EMS1基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中受多個miRNA的調(diào)控。本實驗通過生物信息學(xué)技術(shù)及體外細胞實驗從轉(zhuǎn)錄后水平篩選鑒定出靶向調(diào)控人EMS1基因的miRNAs分子，闡明EMS1基因在胃癌中表達上調(diào)的分子機制，為胃癌的臨床診斷、靶向治療及判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。
　　

2、方法：
　?。?）利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測EMS1基因的靶miRNA分子，并通過pubmed、中國知網(wǎng)等網(wǎng)站進行文獻檢索，篩選出未報道過，可能性較高的miRNAs。
　　（2）選擇陽離子脂質(zhì)體法,將初篩出的靶miRNA mimic/inhibi-tor瞬時轉(zhuǎn)染至胃癌細胞MGC803中,再采用Western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染48h后空白組、miRNA mimic/inhibitor NC對照組及miRNA mimic/inh

3、ibitor實驗組EMS1蛋白的表達變化。
　　（3）利用MTT實驗、劃痕實驗和體外遷移侵襲實驗,檢測瞬時轉(zhuǎn)染miR-545-3p mimic/inhibitor對MGC803細胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為的影響。
　　結(jié)果：生物信息學(xué)結(jié)果顯示：miR-182、miR-501-3p、miR-338-5p、miR-183、miR-502-3p、miR-545、miR-329、miR-603、miR-326、miR-526a、

4、miR-548d-3p等11個miRNA可能是EMS1基因的靶miRNA。文獻檢索結(jié)果顯示：在腫瘤組織中表達上調(diào)的有miR-182、miR-501-3p、miR-338-5p、miR-183、miR-502-3p等5個miRNA；表達下調(diào)的有miR-182、miR-545、miR-603、miR-329、miR-326等5個miRNA；未見報道的有miR-526a和miR-548d-3p。在5個下調(diào)的miRNA中miR-326、miR-

5、182是EMS1基因的靶miRNA已有報道，其余3個miRNA與EMS1基因的相關(guān)性尚未見研究。因此本課題組選出miR-545、miR-329、miR-603可能是EMS1基因的靶miRNA分子。
　　miRNAs與EMS13’UTR靶結(jié)合位點的預(yù)測結(jié)果顯示：miR-545-3p與EMS1的結(jié)合位點為162-168;miR-329-3p與EMS1的結(jié)合位點為863-869和1184-1190；miR-603與EMS1的結(jié)合位點為1

6、042-1048.
　　Western blot實驗結(jié)果顯示：miR-545-3p、miR-329-3p、miR-603三種miRNA mimic瞬時轉(zhuǎn)染MGC803細胞后，與空白組和NC組相比miR-545-3p組EMS1蛋白的表達下降，p<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；miR-329-3p、miR-603組與空白組和NC組相比則EMS1蛋白表達無明顯差異（p>0.05）。將miR-545-3p、miR-329-3p、miR-6

7、03三種miRNA inhbitor分別瞬時轉(zhuǎn)染MGC803細胞后，與空白組和NC組相比miR-545-3p組EMS1蛋白的表達升高（p<0.05）；miR-329-3p、miR-603組與空白組和NC組相比則EMS1蛋白表達變化無明顯差異（p>0.05）。
　　MTT實驗結(jié)果顯示：與空白組和NC組相比，胃癌MGC803細胞瞬時轉(zhuǎn)染miR-545-3p mimic后,細胞增殖能力減弱(p<0.05)；相反地， 瞬時轉(zhuǎn)染m

8、iR-545-3p inhibitor后細胞增殖能力增強（p<0.05）。實驗表明miR-545-3p高表達可以抑制胃癌細胞MGC803的增殖能力；其被抑制后可使MGC803細胞的增殖能力增強。
　　遷移實驗及侵襲實驗結(jié)果顯示：遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示MGC803細胞瞬時轉(zhuǎn)染miR-545-3p mimic后，與空白組和mimic NC組相比細胞遷移和能力均減弱（p<0.05）；MGC803細胞瞬時轉(zhuǎn)染miR-545-3p inhi