1、第一部分:血清miRNA作為胃癌診斷標(biāo)志物的研究
　　背景:胃癌是全球發(fā)病率及死亡率較高的惡性腫瘤之一。由于胃癌患者早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)，且我國(guó)普查手段尚未全面推廣，大多數(shù)患者往往就診不及時(shí)，確診時(shí)已處于進(jìn)展期。考慮到傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物敏感性和特異性的相對(duì)不足，本研究通過對(duì)胃癌患者血清miRNA在較大樣本中的系統(tǒng)性分析，旨在尋找對(duì)胃癌具有潛在診斷價(jià)值的血清miRNA標(biāo)志。
　　方法:運(yùn)用Exiqon miRNA qPCR pa

2、nel進(jìn)行初篩，以初步獲取胃癌患者與正常對(duì)照人群靜脈血清pool中差異表達(dá)的miRNA，隨后進(jìn)一步通過qRT-PCR技術(shù)分別在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集兩個(gè)獨(dú)立樣本中驗(yàn)證所獲得的結(jié)果。并在組織樣本、動(dòng)脈血清以及血清外泌體中對(duì)表達(dá)差異的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)在組織中進(jìn)一步探索了miRNA的預(yù)后價(jià)值。
　　結(jié)果:初篩階段，通過芯片共獲得58個(gè)差異表達(dá)的候選miRNA，其中包括在胃癌血清pool中高表達(dá)的51個(gè)miRNA和7個(gè)低表達(dá)miRNA。通

3、過qRT-PCR在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中對(duì)候選miRNA行進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果表明miR-10b-5p、miR-132-3p、 miR-185-5p、 miR-195-5p、miR-20a-3p和miR-296-5p在胃癌患者血清中呈明顯高表達(dá)。同時(shí)，這6個(gè)miRNA組成的分子標(biāo)簽可以作為區(qū)分胃癌患者和正常對(duì)照人群的分子標(biāo)志物。通過受試者工作特征曲線(ROC)分析，該分子標(biāo)簽在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集所對(duì)應(yīng)的曲線下面積(AUC)分別為0.764和0.702

4、。除了miR-132-3p，另外5個(gè)miRNA在胃癌組織均呈高表達(dá)，miR-10b-5p和miR-296-5p具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。并且在未接受化療的胃癌患者中，組織中miR-10b-5p和miR-296-5p相對(duì)高表達(dá)的患者預(yù)后欠佳。另外，在胃癌患者血清外泌體中，miR-10b-5p、miR-195-5p、miR-20a-3p和miR-296-5p均呈明顯高表達(dá)。然而，這6個(gè)miRNA在動(dòng)靜脈血中的表達(dá)并未呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　

5、結(jié)論:血清miR-10b-5p、miR-132-3p、miR-185-5p、miR-195-5p、miR-20a-3p和miR-296-5p可作為胃癌的潛在診斷標(biāo)志物，且這6個(gè)miRNA所組成的分子標(biāo)簽?zāi)軌蛴行У膮^(qū)分胃癌患者和正常人群。
　　第二部分:血清miRNA作為輔助診斷食管鱗癌標(biāo)志物的研究
　　背景:食管癌是全球常見的惡性消化道腫瘤之一，中國(guó)更是食管癌高發(fā)國(guó)家。食管鱗癌是我國(guó)食管癌的主要病理類型。根治性手術(shù)是最主要的

6、能治愈食管鱗癌的手段，但由于患者往往就診不及時(shí)，食管鱗癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的幾率仍較高，預(yù)后并不理想。目前尚無理想、可靠的食管鱗癌診斷標(biāo)志物。因此，尋找能早期診斷食管鱗癌的分子標(biāo)志物，或可為食管鱗癌診斷和預(yù)后的改善提供新的策略。本研究通過對(duì)食管鱗癌患者的血清miRNA進(jìn)行篩選分析，以期為血清miRNA更好地成為診斷食管鱗癌的標(biāo)志物提供證據(jù)。
　　方法:本研究通過多個(gè)階段的獨(dú)立試驗(yàn)對(duì)血清miRNA進(jìn)行篩選。運(yùn)用ExiqonmiRNA

7、qPCR panel獲取食管鱗癌患者與正常對(duì)照人群靜脈血清pool中差異表達(dá)的miRNA，隨后在訓(xùn)練集、驗(yàn)證集以及額外驗(yàn)證集中，通過qRT-PCR相對(duì)定量法進(jìn)一步驗(yàn)證初篩得到的miRNA。另外，在組織樣本、動(dòng)脈血清、血清外泌體中對(duì)篩選的miRNA進(jìn)行血清中存在形式的分析。
　　結(jié)果:在芯片初篩階段，共篩選出36個(gè)miRNA成為候選miRNA，其中33個(gè)miRNA在食管鱗癌患者血清pool中高表達(dá)，3個(gè)miRNA低表達(dá)。通過qRT-

8、PCR技術(shù)在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集兩個(gè)階段對(duì)候選的miRNA進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)驗(yàn)證，最終結(jié)果證實(shí)miR-20b-5p、 miR-28-3p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-296-5p在食管鱗癌患者血清中呈明顯高表達(dá)。獨(dú)立的額外驗(yàn)證集實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這5個(gè)高表達(dá)的血清miRNA。另外，我們將這5個(gè)miRNA整合為一個(gè)分子標(biāo)簽，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)簽具有鑒別食管鱗癌患者和正常對(duì)照人群的能力。隨后我們通過受試者工作特征曲線（receiver o

9、perating characteristic curve，ROC）分析，得出該分子標(biāo)簽在訓(xùn)練集、驗(yàn)證集和額外驗(yàn)證集三個(gè)階段所對(duì)應(yīng)的曲線下面積(AreaUnder ROC Curve，AUC)分別為0.753、0.763和0.966。同時(shí)5個(gè)候選miRNA在食管鱗癌組織均呈一致性高表達(dá)，并且miR-20b-5p、miR-28-3p和miR-192-5p具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而miR-296-5p在食管鱗癌患者血清外泌體中表達(dá)明顯上調(diào)。這5個(gè)m