1、目的:將外源性人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)導入到新西蘭大白兔第二代關(guān)節(jié)軟骨細胞,探討該基因能否激活兔關(guān)節(jié)軟骨細胞的端粒酶活性,并延長細胞在體外培養(yǎng)的壽命,并為以后的永生化兔關(guān)節(jié)軟骨細胞系的建立奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:1.用脂質(zhì)體方法將質(zhì)粒pLEGFP-C1-hTERT分別穩(wěn)轉(zhuǎn)和瞬轉(zhuǎn)PT67包裝細胞,收集病毒上清液,并用NIH3T3細胞測定病毒上清液的病毒滴度；2.第二代兔關(guān)節(jié)軟骨細胞分別被上述兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液感染后,經(jīng)G4

2、18藥物壓力篩選獲得克隆細胞并擴增,從而初步建立永生化兔關(guān)節(jié)軟骨細胞；3.用RT-PCR方法檢測永生化兔關(guān)節(jié)軟骨細胞中的hTERT-mRNA表達,并與第二代的兔關(guān)節(jié)軟骨細胞相比較。
　　 結(jié)果:1.質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)包裝細胞后經(jīng)G418篩選后獲得了穩(wěn)定產(chǎn)毒的抗性細胞株,通過RT-PCR檢測抗性克隆株(PT67-hTERT)中的hTERT-mRNA表達,并和正常PT67細胞相對照。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在抗性克隆株P(guān)T67和正常PT67細胞中均可見一

3、條擴增帶,但抗性克隆株P(guān)T67的條帶明顯強于正常組PT67(p＜0.05)。說明hTERT-mRNA在正常的PT67細胞株中就有轉(zhuǎn)錄,但其外源性的hTERT基因使其轉(zhuǎn)錄明顯增強。并測得穩(wěn)轉(zhuǎn)后病毒的滴度為2.0×105CFU/ml;瞬轉(zhuǎn)包裝細胞產(chǎn)生的病毒上清液的病毒滴度為1.0×106CFU/ml。2.經(jīng)流式細胞儀檢測,穩(wěn)轉(zhuǎn)包裝細胞產(chǎn)生的病毒上清液感染兔第二代關(guān)節(jié)軟骨細胞的感染率是28.55±6.99％,瞬轉(zhuǎn)包裝細胞產(chǎn)生的病毒上清液感染兔

4、第二代關(guān)節(jié)軟骨細胞的感染率是81.42±11.45%。未感染的兔第二代關(guān)節(jié)軟骨細胞做為空白對照,其感染率為0.23±0.05%。通過方差分析p＜0.05,認為兩種病毒感染方法有顯著性差異。3.RT-PCR檢測永生化兔關(guān)節(jié)軟骨細胞的hTERT-mRNA表達時,可見145bp的特異性電泳帶,而未感染的第二代兔關(guān)節(jié)軟骨細胞卻未見條帶,說明hTERT基因被成功導入到第二代兔關(guān)節(jié)軟細胞中并被表達。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建