1、肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞組成的內(nèi)皮屏障，維持著肺間質(zhì)與血液中的滲透壓平衡，調(diào)控著血液中炎癥細(xì)胞、蛋白等物質(zhì)的運(yùn)輸。各種因素導(dǎo)致的內(nèi)皮連接破壞、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及壞死破壞了內(nèi)皮屏障的完整性，影響了內(nèi)皮屏障功能，導(dǎo)致了血漿蛋白及致炎因子滲出、肺間質(zhì)及肺泡水腫。故內(nèi)皮完整性的破壞及內(nèi)皮滲透性的增高是急性肺損傷重要發(fā)病病理基礎(chǔ)之一，研究其發(fā)生機(jī)制，有利于急性肺損傷的干預(yù)及治療。
　　革蘭氏陰性桿菌感染是急性肺損傷的重要誘發(fā)因素之一，革蘭氏陰性桿菌的崩

2、解產(chǎn)物脂多糖(LPS)是炎癥反應(yīng)的重要促發(fā)因子，其可與細(xì)胞表面TLR4受體特異性結(jié)合，激活TLR4-NF-κB信號(hào)通路并由此誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，過(guò)度激活的TLR4-NF-κB信號(hào)將導(dǎo)致炎癥的發(fā)生和發(fā)展。另外，TLR4不僅能識(shí)別LPS等病原體相關(guān)分子模式，其對(duì)于無(wú)菌性損傷后產(chǎn)生的內(nèi)源性致炎因子即損傷相關(guān)分子模式也有應(yīng)答反應(yīng)。故TLR4不僅能應(yīng)答由革蘭氏陰性桿菌感染所引起的炎癥反應(yīng)，也能應(yīng)答由非特異損傷導(dǎo)致的無(wú)菌性炎癥。由此可見，在急

3、性肺損傷中，TLR4及其下游信號(hào)通路的激活及失控可能在炎癥的發(fā)生、發(fā)展及失控中發(fā)揮重要作用。既往研究表明:TLR4可在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，參與了多種炎癥信號(hào)的傳遞過(guò)程，將TLR4過(guò)表達(dá)后將加重肺損傷，而抑制TLR4信號(hào)傳遞后可以阻止肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白的重排，抑制細(xì)胞間縫隙的形成并由此減輕或阻止肺水腫的發(fā)生。故TLR4可能成為急性肺損傷及急性呼吸窘迫綜合癥治療中一個(gè)重要的干預(yù)靶點(diǎn)。
　　Rab蛋白是一類小GTP結(jié)合蛋白，具

4、有GTP酶活性，故又稱為Rab GTPase，其能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)的運(yùn)輸，并由此調(diào)控囊泡內(nèi)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)。不同的Rab蛋白具有不同的功能，我們先前的研究揭示了，Rab1可調(diào)控β2-腎上腺素受體及血管緊張素Ⅱ1型受體在大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)的分布，Rab5a可調(diào)節(jié)β2-腎上腺素受體在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)及胞膜上的表達(dá)，也能夠調(diào)節(jié)該細(xì)胞中VE-cadherin的內(nèi)吞及F-actin的定位。而Rab26是一種主要調(diào)控順向轉(zhuǎn)

5、運(yùn)的Rab蛋白，可以調(diào)控囊泡從高爾基體到細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。而TLR4作為膜受體在細(xì)胞內(nèi)合成后需轉(zhuǎn)運(yùn)至胞膜才能應(yīng)答配體傳遞的刺激，那么，Rab26能否調(diào)節(jié)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4受體的轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)，繼而引起其對(duì)LPS等致炎因子應(yīng)答的改變，并由此調(diào)控肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能？目前尚不清楚。
　　納米材料在醫(yī)學(xué)研究及診治中有著巨大的應(yīng)用前景。早期的研究主要集中在無(wú)機(jī)納米材料的應(yīng)用方面，例如常見的有納米金在診斷中的應(yīng)用及納米銀在抗菌方面的應(yīng)用

6、等。因納米材料具有多種特有的優(yōu)勢(shì)，在生命科學(xué)領(lǐng)域，近幾十年來(lái)各種先進(jìn)的納米材料被合成。而通過(guò)DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)自組裝而成的納米材料，因其具有成本低廉、組裝容易、易編程、可修飾等特性，非常便于在醫(yī)學(xué)研究以及診斷治療的應(yīng)用，而其作為載體在遞送siRNA進(jìn)行研究和基因診斷治療方面有著低毒、低免疫原性、血清穩(wěn)定性佳等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。在本研究中，我們合成了兩種納米載體ssRNA-TNP及siRab26-DYM，分別探討了這兩種納米載體與單一siRNA相

7、比的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。并使用納米載體研究了Rab26對(duì)LPS引起的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR4及NF-κB P65變化所產(chǎn)生影響。然后，我們還檢測(cè)了Rab26對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及滲透性的影響，進(jìn)一步明確了Rab26在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)對(duì)炎癥因子刺激時(shí)所發(fā)揮的作用。
　　目的:
　　1.合成具有低毒性及良好轉(zhuǎn)染效果的DNA自組裝納米載體。
　　2.明確Rab26對(duì)HPMVECs中TLR4及下游信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。
　　3.

8、探討Rab26對(duì)HPMVECs細(xì)胞凋亡及內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的影響。
　　方法:
　　1.構(gòu)建并驗(yàn)證DNA自組裝納米載體。
　　(1)構(gòu)建能夠攜帶mTOR siRNA的DNA三角板納米載體，檢測(cè)其產(chǎn)率、轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞攝取率。
　　(2)構(gòu)建能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)運(yùn)Rab26siRNA的DNA三臂Y型模體結(jié)構(gòu)納米載體siRab26-DYM，并檢測(cè)其納米載體產(chǎn)率、轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞攝取率。
　　(3)使用RT-PCR及WB檢測(cè)siR

9、ab26-DYM對(duì)HPMVECs細(xì)胞中Rab26基因表達(dá)的干擾效果。
　　2.培養(yǎng)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，檢測(cè)LPS及Rab26對(duì)HPMVECs細(xì)胞Rab26、TLR4及其下游信號(hào)通路的影響。
　　(1)使用Westernblot探測(cè)HPMVECs中Rab26及TLR4的表達(dá)變化。
　　(2)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HPMVECs細(xì)胞膜TLR4的改變。
　　(3)使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Rab26對(duì)HPMVECs細(xì)胞膜TLR4受

10、體的調(diào)節(jié)作用。
　　(4)使用WB檢測(cè)Rab26對(duì)HPMVECs細(xì)胞總TLR4蛋白及其下游通路分子NF-κBP65的調(diào)控。
　　3.檢測(cè)LPS及Rab26對(duì)HPMVECs細(xì)胞凋亡率及其內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的影響
　　(1)使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Rab26對(duì)HPMVECs細(xì)胞凋亡率的影響。
　　(2)使用Transwell小室培養(yǎng)HPMVECs，通過(guò)檢測(cè)FITC-dextran的透過(guò)率以反映HPMVECs內(nèi)皮細(xì)胞通透性。

11、r>　　結(jié)果:
　　1.成功組裝了能攜帶mTOR siRNA的DNA自組裝三角板納米載體以及能攜帶Rab26siRNA的Y形模體結(jié)構(gòu)納米載體。凝膠電泳結(jié)果分析顯示:通過(guò)階梯降溫法納米載體能完成自組裝并達(dá)到較高的產(chǎn)率。
　　2.攜帶mTOR siRNA的DNA自組裝三角板納米載體以及攜帶Rab26siRNA的Y型模體納米載體能被細(xì)胞高效攝入。通過(guò)對(duì)攜帶Rab26siRNA的Y型模體納米載體的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其能高效沉默目的基因

12、Rab26的表達(dá)，且具有濃度及時(shí)間依賴性，RT-PCR及Westernblot結(jié)果顯示此種納米載體能導(dǎo)致HPMVECs細(xì)胞中目的基因Rab26在mRNA及蛋白水平的表達(dá)下降。
　　3.LPS處理HPMVECs后Rab26的表達(dá)出現(xiàn)了下降，細(xì)胞膜TLR4及細(xì)胞總TLR4蛋白的表達(dá)出現(xiàn)了上升。
　　4.下調(diào)HPMVECs細(xì)胞中Rab26能提高細(xì)胞膜TLR4、細(xì)胞總TLR4以及下游NF-κBP65的表達(dá)，而上調(diào)HPMVECs細(xì)胞中

13、的Rab26能降低由LPS引起的TLR4及NF-κB P65的升高。
　　5.LPS處理HPMVECs后，細(xì)胞的凋亡率增高，而下調(diào)HPMVECs細(xì)胞Rab26的表達(dá)，能與LPS協(xié)同作用提高HPMVECs細(xì)胞的凋亡,上調(diào)HPMVECs細(xì)胞中Rab26能降低LPS刺激后出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡。
　　6.LPS刺激后，HPMVECs細(xì)胞滲透性出現(xiàn)了提高，而下調(diào)Rab26能與LPS協(xié)同作用進(jìn)一步提高HPMVECs內(nèi)皮細(xì)胞滲透性，上調(diào)Rab2

14、6能一定程度降低由LPS刺激所導(dǎo)致的HPMVECs內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的提高。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建能夠自組裝的攜帶mTOR siRNA的DNA自組裝三角板納米載體及能攜帶Rab26siRNA的DNA納米Y型模體納米載體，其合成方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高，這兩種納米載體能夠高效的轉(zhuǎn)入細(xì)胞。對(duì)攜帶Rab26siRNA的DNA納米Y型模體納米載體的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其能高效的干擾目標(biāo)基因的表達(dá)。
　　2.LPS可降低HPMVECs中