1、目的：觀察退變椎間盤終板軟骨細胞衰老的表現(xiàn)以及氧化應(yīng)激對終板軟骨細胞衰老的影響，探討SIRT1對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的終板軟骨細胞衰老的調(diào)控作用以及相關(guān)機制，為進一步揭示椎間盤軟骨終板的退變機制提供相關(guān)實驗基礎(chǔ)。
　　方法：取因腰椎爆裂骨折（LVF組，退變輕）及椎間盤退變性疾?。―DD組，退變嚴重），行椎間盤切除術(shù)的椎間盤組織分離得到終板軟骨組織，進行大體標本觀察、組織學(xué)檢測（常規(guī)HE染色，免疫組織化學(xué)染色），觀察不同退變程度終板軟骨組織

2、中細胞的外形及SIRT1、p53、p21、p16蛋白表達情況。
　　提取原代終板軟骨細胞，進行細胞擴增、培養(yǎng)；并采用致死量以下的H2O2進行氧化應(yīng)激處理，觀察對細胞的影響，構(gòu)建細胞衰老模型；并采用流式細胞儀、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色、定量PCR、WB等方法檢測細胞的凋亡、周期分布，以及細胞衰老相關(guān)信號通路的激活情況。
　　構(gòu)建高表達SIRT1的腺病毒Ad-SIRT1并驗證其表達及功能，以Ad-GFP為對照，并應(yīng)用SIRT1

3、基因特異性抑制劑nicotinamide、p53特異性抑制劑PFT-α，調(diào)控SIRT1表達及衰老相關(guān)信號通路的活性后，采用流式細胞儀、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色、免疫熒光、定量PCR、WB等方法檢測細胞的周期分布，以及衰老相關(guān)基因的表達的定位及定量情況。進而探討SIRT1對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的終板軟骨細胞衰老的調(diào)控作用及機制。
　　結(jié)果：DDD組椎間盤終板軟骨組織較LVF組顏色偏黃，鈣化明顯，HE染色顯示其大多細胞相對變扁，而LVF組細

4、胞相對成圓形。免疫組織化學(xué)提示DDD組SIRT1陽性細胞率較LVF組明顯減少（P＜0.05），而DDD組p53、p21的陽性細胞率較LVF組明顯增加（P＜0.05），而p16的陽性細胞率兩組中尚未見明顯差異（P＞0.05），DDD組原代細胞中衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率明顯高于LVF組（P＜0.05）。
　　致死量以下H2O2進行氧化應(yīng)激處理終板軟骨P2代細胞后，兩組（Control組、H2O2組）細胞凋亡率未見明顯差異（

5、P＞0.05），而細胞周期中G1期細胞的比例H2O2組明顯高于Control組（P＜0.05），且衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率 H2O2組明顯高于Control組（P＜0.05），并且H2O2組中II型膠原的表達明顯降低，而MMP13的表達明顯增高；p53乙酰化水平及p21的mRNA及蛋白水平H2O2組都明顯高于Control組（P＜0.05），p38磷酸化水平及p16的mRNA及蛋白水平H2O2組與Control組未見明顯差異

6、（P＞0.05）。
　　腺病毒過表達SIRT1后，H2O2+Ad-SIRT1組較對照組（H2O2組）明顯抑制p53乙酰化水平及抑制p21的表達（P＜0.05），同時降低β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率（P＜0.05），并使得細胞周期中G1期細胞的比例明顯降低（P＜0.05）；而H2O2+Nic組抑制SIRT1的表達后，較對照組（H2O2組）明顯增加了p53乙?；郊皃21的表達（P＜0.05），衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率增

7、高（P＜0.05），同時細胞周期中G1期細胞的比例明顯增高（P＜0.05）。
　　在氧化應(yīng)激條件，細胞免疫熒光染色提示SIRT1定位于細胞核內(nèi)，而p53出現(xiàn)明顯向細胞核內(nèi)聚集，進一步提示SIRT1與p53可能存在相互作用。而H2O2+Nic+PFT-α組在氧化應(yīng)激下使用Nic抑制SIRT1，激活p53/p21信號通路后，再使用p53特異性抑制劑PFT-α后，p21的表達水平較 H2O2+Nic組明顯降低（P＜0.05），同時衰老相

8、關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率降低（P＜0.05），細胞周期中G1期細胞的比例也明顯降低（P＜0.05），同時與單純氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細胞衰老后直接加入PFT-α即H2O2+PFT-α組比較，p21的表達水平、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率、G1期細胞的比例并無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。進一步提示p53/p21是SIRT1調(diào)控氧化應(yīng)激條件下終板軟骨細胞衰老的重要信號通路。
　　結(jié)論：退變椎間盤終板軟骨細胞存在明顯衰老表型，而氧化應(yīng)激條件下p