1、(Ⅰ)Poly(A)幾乎存在于所有真核生物的mRNA3’端，并且影響著mRNA幾乎所有的代謝活動(dòng)：轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和降解。目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有兩種不同的Poly(A)結(jié)合蛋白，它們分別是細(xì)胞質(zhì)中的PABPC和細(xì)胞核中的PABPN1。 PABPC存在于所有的真核生物中，具有起始翻譯和調(diào)控RNA降解的功能。在其N(xiāo)端具備四段高度保守的RRM(亦稱(chēng)為RBD)，RRM1和RRM2分別與RRM3和RRM4非常類(lèi)似，前兩個(gè)RRM是主要的用于特

2、異性結(jié)合poly(A)的區(qū)域。在人PABPC(RRM1/RRM2)和oligo(A)復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中，β-sheet形成的平臺(tái)結(jié)合了一個(gè)處于伸展?fàn)顟B(tài)構(gòu)象的寡聚核苷酸，每個(gè)RRM大約結(jié)合了4個(gè)核苷酸。 PABPN1(曾被命名為PABP2、PAB Ⅱ)是目前在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的唯一存在于細(xì)胞核內(nèi)的poly(A)結(jié)合蛋白，它可以通過(guò)刺激poly(A)合成酶活性來(lái)促進(jìn)poly(A)的合成，控制poly(A)尾巴的長(zhǎng)度。在生理?xiàng)l件下，該蛋白

3、始終處于單體、二聚體和多聚體的動(dòng)態(tài)平衡之中，這是其發(fā)揮功能的重要環(huán)節(jié)。PABPN1-poly(A)復(fù)合物可以形成球形顆粒和線形狀態(tài)，并且在兩者之間有動(dòng)態(tài)平衡。這種動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)很可能是作為一種分子標(biāo)尺來(lái)決定poly(A)的長(zhǎng)度。PABPN1酸性的N-端domain是促進(jìn)poly(A)合成酶活性必不可少的，C-端的富含Arg的區(qū)域和中部的RRM共同用來(lái)結(jié)合poly(A)，但只有RRM具有特異性結(jié)合的能力。雖然PABPN1結(jié)合poly(A)的能

4、力與PABPC相當(dāng)，但前者只含有一個(gè)高度保守的RRM結(jié)構(gòu)域。從一級(jí)結(jié)構(gòu)比較來(lái)看，PABPN1-RRM與目前已知結(jié)構(gòu)的RRM同源性非常低，包括PABPC的RRMs。 通過(guò)原核表達(dá)得到人PABPN1-RRM結(jié)構(gòu)域并進(jìn)行晶體生長(zhǎng)，在同一條件下(同一液滴中)同時(shí)獲得了兩種不同空間群的晶體，分別解析了它們的結(jié)構(gòu)。第一個(gè)結(jié)構(gòu)利用單波長(zhǎng)散射方法解析了2.0 A分辨率的晶體，該晶體屬于I23空間群，晶胞參數(shù)分別為：a=b=c=92.35A，最后

5、的結(jié)構(gòu)修正參數(shù)為：R因子17.4％，Rfree 20.7％。第二個(gè)結(jié)構(gòu)利用分子置換方法解析了2.82 A分辨率的晶體，該晶體屬于P3<,l>空間群，晶胞參數(shù)分別為：a=b=59.34 A，c=80.60A：γ=120.00°，最后的結(jié)構(gòu)修正參數(shù)為：R因子22.6％，Rfree 29.0％。PABPN1-RRM具有典型的RRM的αβ-sandwich空間結(jié)構(gòu)：β1α1β2β3α2β4；面向β-sheet從左向右依次為β4β1β3β2形成了

6、一個(gè)β-sheet的平面，在其后方有兩個(gè)接近90°的α-helix。但與其他RRM比較，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)特點(diǎn)使得PABPN1 RRM有著顯著的不同：loop3的走向和二聚化作用。 (Ⅱ)5-氨基酮戊酸(ALA)是四碳合成途徑當(dāng)中首要的供體，植物，藻類(lèi)和一些細(xì)菌也可以通過(guò)五碳途徑從谷氨酸合成5-氨基酮戊酸。在這個(gè)途徑中一系列的酶發(fā)揮著重要的作用，谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶(GSA-AT)是這個(gè)途徑的最后一個(gè)酶。其他兩個(gè)重要的酶是谷氨酸-tR

7、NA合成酶和谷氨酸-tRNA還原酶。 從基因組文庫(kù)中克隆了GSA-AT的CDS序列，并構(gòu)建了GSA-AT-p28a質(zhì)粒。重組蛋白GSA-AT-HisTag在E．coli BL21(DE3)中表達(dá)量很高，用Ni親和柱純化后純度達(dá)到95％以上。蛋白質(zhì)在濃縮和脫鹽過(guò)程中比較穩(wěn)定，動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組蛋白是以單體的形式存在。用懸滴氣相擴(kuò)散法經(jīng)過(guò)篩選和優(yōu)化得到了GSA-AT的晶體。晶體的衍射分辨率為2.3A并完成了晶體衍射數(shù)據(jù)的收集，晶

8、體空間群為C2，晶胞參數(shù)為a=109.25A，b=55.76A，c=80.50A，a=γ=90.00°，β=132.02°。一個(gè)晶體學(xué)不對(duì)稱(chēng)單位含有一個(gè)蛋白質(zhì)分子。用分子置換法已獲得結(jié)構(gòu)的初相位，最后的結(jié)構(gòu)修正參數(shù)為：R因子19.3％，Rflee 23.4％。 通過(guò)對(duì)GSA-AT三維空間結(jié)構(gòu)分析，該分子單體分別由N末端domain(約65個(gè)氨基酸形成的兩段α螺旋和三段反向的β片組成)、輔基結(jié)合區(qū)(65-320，包括一個(gè)由7段β-