1、目的：
　　建立中空纖維細(xì)胞捕獲-高效液相色譜法（Hollow fiber cell fishing with high performance liquid chromatography，HFCF-HPLC）對(duì)白芷中香豆素類成分進(jìn)行體內(nèi)外抗癌活性成分篩選和鑒定；建立中空纖維液相微萃取-高效液相色譜法（Ho llo w fibe r liquid phase microextraction with HPLC，HFLPME-HPL

2、C）對(duì)白芷中篩選出的香豆素類活性成分進(jìn)行體內(nèi)外含量測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)研究；結(jié)合香豆素類成分的抗癌活性篩選、鑒定、含量測(cè)定及多組分藥動(dòng)學(xué)，溝通白芷中香豆素類抗癌活性成分在體內(nèi)外的關(guān)系，初步尋找真正抗癌的香豆素類成分，為闡明白芷中香豆素類的抗癌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　?。?）對(duì)可能影響 HFCF-HPLC法的的各種因素，如分別種植于纖維內(nèi)壁上的人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3，人腎癌細(xì)胞ACHN，人肝癌細(xì)胞He

3、pG-2的生長(zhǎng)狀態(tài)、存活率、乙醇濃度對(duì)HepG-2細(xì)胞存活率的影響、纖維活性中心或培養(yǎng)液對(duì)篩選結(jié)果的影響、篩選出的活性成分保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的重現(xiàn)性等，進(jìn)行考察和優(yōu)化。在最佳HFCF-HPLC條件下，以補(bǔ)骨脂素、佛手苷內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和異歐前胡素作為模型化合物，將分別種植3種癌細(xì)胞的中空纖維或充滿HepG-2細(xì)胞膜、細(xì)胞器混懸液的纖維插入白芷醇提液、水煎液及含藥血漿或含藥肝、腎組織勻漿中，對(duì)白芷中的香豆素類成分進(jìn)行體內(nèi)外活性

4、成分篩選和鑒定，初步明確香豆素類成分與3種癌細(xì)胞的結(jié)合能力。（2）對(duì)影響HF LPM E-HPLC法的因素，如萃取劑種類及其比例、樣品相 pH、萃取時(shí)間和轉(zhuǎn)速等，進(jìn)行條件優(yōu)化，對(duì)該法的線性范圍、檢測(cè)限、定量限、精密度和準(zhǔn)確度，進(jìn)行方法學(xué)考察。在最佳 HFLPM E-HP LC條件下，以補(bǔ)骨脂素、佛手苷內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和氧化前胡素作為模型化合物，利用HFLPM E-HP LC法對(duì)白芷中篩選出的抗癌活性成分，特別是微量活性成分，進(jìn)

5、行含量測(cè)定；并用該法對(duì)白芷灌胃給藥后的多成分藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。結(jié)合白芷香豆素類成分的抗癌活性篩選、鑒定、含測(cè)及多組分藥動(dòng)學(xué)研究的結(jié)果，探討白芷在體內(nèi)真正起效的香豆素類抗癌活性成分。
　　結(jié)果：
　　在最佳HFCF和HFLPME偶合HPLC法實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)白芷中香豆素類成分進(jìn)行研究，可以得出：（1）白芷藥材中與3種癌細(xì)胞結(jié)合的香豆素類成分至少有花椒毒酚、花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、佛手苷內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和異歐前胡素，其中能

6、夠定量的香豆素類成分有補(bǔ)骨脂素（1.36μg/g）、佛手苷內(nèi)酯（3.05μg/g）、氧化前胡素（22.30μg/g）、歐前胡素（7.78μg/g）和異歐前胡素（2.83μg/g）；（2）白芷口服灌胃給藥后，體外篩選出的7種香豆素類成分均能吸收入血，之后測(cè)得含藥血漿中補(bǔ)骨脂素、佛手苷內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和異歐前胡素的Cmax（The mean peak concentration）分別是0.36、0.23、0.08、1.20和0.4

7、7μg/mL，其中作用于ACHN和 HepG-2細(xì)胞的成分僅有花椒毒酚、花椒毒素、佛手苷內(nèi)酯和歐前胡素；（3）在含藥腎組織中能檢測(cè)到活性成分有補(bǔ)骨脂素（0.72μg/g）、佛手苷內(nèi)酯（0.46μg/g）、歐前胡素（0.22μg/g）、異歐前胡素（0.62μg/g）以及花椒毒酚和花椒毒素，其中僅花椒毒酚、花椒毒素、佛手苷內(nèi)酯和歐前胡素能作用于ACHN細(xì)胞；（4）在含藥肝組織中能檢測(cè)到活性成分有氧化前胡素（1.03μg/g）、歐前胡素（0.

8、41μg/g）、異歐前胡素（0.10μg/g）以及花椒毒酚和花椒毒素，僅有花椒毒酚和花椒毒素能與HepG-2細(xì)胞作用；（5）利用HFLPM E-HP LC法對(duì)白芷口服灌胃后的多成分藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，同時(shí)測(cè)定其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
　　結(jié)論：
　　HFCF和HFLPME偶合HPLC法成功應(yīng)用于白芷中微量香豆素類化合物的抗癌活性成分篩選、定性、含量測(cè)定及多成分藥代動(dòng)力學(xué)研究。在本實(shí)驗(yàn)條件下，白芷在體外篩選出的抗癌香豆素類成分是花椒

9、毒酚、花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、佛手苷內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和異歐前胡素，它們與細(xì)胞的結(jié)合能力與其在白芷中的含量無(wú)關(guān)；體內(nèi)篩選結(jié)果與體外篩選結(jié)果有一定的差異，血漿中
　　能夠與 ACHN細(xì)胞和 HepG-2細(xì)胞作用的是花椒毒酚、花椒毒素、佛手苷內(nèi)酯和歐前胡素，腎組織中僅花椒毒酚、花椒毒素、佛手苷內(nèi)酯和歐前胡素能與ACHN細(xì)胞作用，肝組織中只有花椒毒酚和花椒毒素能與 HepG-2細(xì)胞作用，且篩選出的活性成分在相應(yīng)的靶組織可以保持一定有

10、效濃度，由此可見，白芷中的微量香豆素類成分具有抗腎癌 ACHN細(xì)胞和肝癌 HepG-2細(xì)胞的作用；但5種香豆素類成分在體內(nèi)的達(dá)峰時(shí)間相似，長(zhǎng)期服用白芷藥材可能會(huì)引起毒性成分的累積。另外，HFCF和 HFLPME偶合 HPLC法可用來(lái)研究中藥中抗癌生物活性成分，特別是微量活性成分。HFCF和 HFLPME的結(jié)合為我們研究中藥抗癌活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供一個(gè)新思路和新方法。
　　本課題承蒙國(guó)家青年科學(xué)基金“中空纖維/石墨烯/有機(jī)溶劑固-