1、目的：研究不同來源成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)特征和生物學(xué)活性，探討成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)的最佳方法及作為骨組織工程種子細(xì)胞的可行性和應(yīng)用價(jià)值，為骨組織工程的研究提供穩(wěn)定可靠的種子細(xì)胞來源。方法：無菌條件下取新生新西蘭兔脛骨骨膜和骨髓，PBS沖洗3次，0.25％胰蛋白酶消化20分鐘，以徹底去除殘留在組織塊上的血污，再將骨膜剪成大小約為1×1mm的組織塊，將骨膜組織塊放入25ml培養(yǎng)瓶中，加入含10％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液2ml，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后

2、進(jìn)行傳代培養(yǎng)。注射器肝素化后抽取完全DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，將混合DMEM培養(yǎng)液加入到無菌離心管內(nèi)，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心，去除最上面的脂肪層，以1×106/cm2密度接種于100ml培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。3天后全量換液，細(xì)胞匯合成單層后用0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳代后改用含地塞米松(1×10-8mol/l)、β-甘油磷酸鈉(10mmol/l)、維生素C(50mg/ml)的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)。取第5代生長(zhǎng)旺盛的成骨細(xì)

3、胞，胰蛋白酶消化后，以107/ml的濃度封入凍存管進(jìn)行超低溫凍存，一個(gè)月后復(fù)蘇，以106/ml的濃度接種在含有5mlDMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。每種方法培養(yǎng)的細(xì)胞每日在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，通過Gomori鈣鈷法進(jìn)行堿性磷酸酶染色，vonKossa法進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)染色，觀察細(xì)胞體外基質(zhì)分泌和骨化過程。 結(jié)果：骨膜培養(yǎng)第3天可見少量的梭形細(xì)胞從組織塊周圍游出，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，圍繞組織塊周圍呈放射狀生長(zhǎng)，10天時(shí)

4、細(xì)胞融合成單層。傳代后的細(xì)胞呈梭形、多角形，帶有粗大的突起，4天時(shí)融合成單層。組織塊培養(yǎng)的原代和傳代細(xì)胞均有活躍的增殖能力，堿性磷酸酶染色及鈣結(jié)節(jié)染色陽(yáng)性。骨髓培養(yǎng)剛接種時(shí)細(xì)胞呈球形懸浮于培養(yǎng)液中，4～5天時(shí)貼壁細(xì)胞開始增殖呈克隆樣生長(zhǎng)，10～12天細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底。細(xì)胞傳代后5天匯合成單層，細(xì)胞增殖旺盛，骨髓培養(yǎng)的原代細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽(yáng)性率低于傳代后細(xì)胞的陽(yáng)性率。傳代細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽(yáng)性率高，鈣結(jié)節(jié)染色呈陽(yáng)性。 結(jié)論：兩種來源

5、的細(xì)胞均表現(xiàn)典型成骨細(xì)胞的形態(tài)特征和較強(qiáng)的生物學(xué)活性，均可作為骨組織工程種子細(xì)胞的可靠來源。細(xì)胞凍存復(fù)蘇后形態(tài)特征和生物學(xué)活性變化不大，可作為保存細(xì)胞的一種方法。 目的觀察成骨細(xì)胞同種異體移植的成骨情況及免疫反應(yīng)，比較凍存成骨細(xì)胞和未凍存細(xì)胞在成骨能力和免疫原性方面的差異，探討同種異體成骨細(xì)胞移植的可行性，為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。 方法取新生新西蘭大白兔脛骨骨髓，分離后加入條件培養(yǎng)液體外培養(yǎng)原代成骨細(xì)胞，細(xì)胞傳代后，對(duì)細(xì)

6、胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)、堿性磷酸酶(ALP)染色及體外礦化能力的檢測(cè)。取第5代生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞一部分進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，另一部分采用超低溫凍存的方法保存，1個(gè)月后復(fù)蘇，取復(fù)蘇后生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，與未凍存細(xì)胞在成骨情況、免疫反應(yīng)方面進(jìn)行比較。將凍存和未凍存的兩種細(xì)胞以2×107/ml濃度分別與磷酸三鈣(TCP)復(fù)合，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后用于植入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。30只新西蘭大白兔為移植受體，隨機(jī)分為A、B、C三組，將兩種復(fù)合體和

7、單純TCP材料分別植入到兔腹直肌肌袋內(nèi)，每組10只，共三組，A組(凍存細(xì)胞組)、B組(未凍存細(xì)胞組)、C組(單純材料組)。術(shù)后第1、2、4、8、12周分別取標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)觀察、血清特異性抗體檢測(cè)、淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)。 結(jié)果實(shí)驗(yàn)組各兔移植術(shù)后無一例發(fā)生感染，切口均為一期愈合，未見明顯全身及局部排斥反應(yīng)，A、B兩組移植后第2、4周檢測(cè)到特異性抗體，8周時(shí)已檢測(cè)不到特異性抗體，細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)于術(shù)后