1、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)作為典型的+ssRNA病毒，是寄主最多、分布最廣、對農(nóng)作物危害最為嚴(yán)重的植物病毒之一；由于基因組分布在3條RNA分子，基因組結(jié)構(gòu)簡單，CMV是研究RNA病毒致病機(jī)制的模式病毒之一。本論文就CMV的2b基因與satRNA互作進(jìn)行以下方面的研究： 1．黃瓜花葉病毒褪綠分離物基因組全長克隆及侵染性克隆構(gòu)建 杭州郊區(qū)的辣椒樣品經(jīng)ELISA檢測和SDS-PAGE病毒粒子

2、分析，結(jié)果表明：引起大田辣椒產(chǎn)生褪綠黃化癥狀的病原物為黃瓜花葉病毒，CMV-Phy。CMV-Phy病毒粒子RNA分析發(fā)現(xiàn)該CMV攜帶satRNA 。將辣椒樣品汁液摩擦接種于心葉煙，接種14 d所引起的癥狀與CMV-Phy癥狀相似。 以病毒粒子的RNA為模板，在一個RT-PCR反應(yīng)中通過升溫PCR同時獲得 CMV-Phy基因組RNA1、RNA2和RNA3的eDNA。5種感受態(tài)細(xì)胞與CMV-Phy基因組eDNA連接產(chǎn)物(pUC-P1

3、、pUC-P2和pUC-P3)進(jìn)行轉(zhuǎn)化結(jié)果表明：HB101最適合CMV-Phy的轉(zhuǎn)化。測序結(jié)果顯示pUC-P1、pUC-P2和pUC-P3大小分別為：3356nt，3048 nt和2220nt。CMV-Phy所攜帶的satRNA的大小為384nt。CMV-Phy基因組RNA1、RNA2和RNA3與已報道其它CMV株系序列同源性結(jié)果表明：CMV-Phy RNAl和RNA2屬于Subgroup IA，而RNA3為Subgroup IB。因此

4、，CMV-Phy為重組型病毒。 CMV-Phy基因組eDNA克隆在5’端添加G體外轉(zhuǎn)錄時有利于提高轉(zhuǎn)錄效率，但會降低其侵染活性。CMV-Phy基因組體外轉(zhuǎn)錄RNA在莧色藜和心葉煙產(chǎn)生的癥狀與其病毒粒子所產(chǎn)生的癥狀相一致。CMV-Phy轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與其它3個CMV-satRNA進(jìn)行假重組，結(jié)果表明：CMV-Phy除了支持自身攜帶Pz-satRNA在心葉煙上高含量的積累，同時也能支持其它3個CMV-satRNA在心葉煙上積累，Tlsat

5、RNA加重CMV-Phy在寄主上的癥狀，但其它的3個RNA減輕CMV-Phy在寄主上的癥狀。 2．2b蛋白第55位亮氨酸決定CMV-CB7在心葉煙上系統(tǒng)性壞死 CMV番茄株系在心葉煙上引起系統(tǒng)性壞死反應(yīng)。CMV-CB7基因組RNA1，RNA2和RNA3大小分別為3356 nt，3045 nt和2218 nt。CMV-CB7基因組cDNA克隆體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在心葉煙上同樣產(chǎn)生系統(tǒng)性壞死癥狀。由CMV-CB7和CMV-Fny基因

6、組產(chǎn)生假重組病毒C1C2F3，C1F2C3，F(xiàn)1C2C3，F(xiàn)1F2C3，F(xiàn)1C2F3以和C1F2F3以及CMV-CB7和CMV-Fny的RNA2分別構(gòu)建嵌合型RNA2(RNA2 F5C3和RNA2 C3F5)在寄主上活性測定的結(jié)果表明，2b基因或3，端非編碼序列決定 CMV-CB7在心葉煙上產(chǎn)生的壞死癥狀。Northern雜交結(jié)果顯示CMV-CB7和 CMV-Fny F3C3引起寄主植物的系統(tǒng)性壞死癥狀不是由于基因組含量比CMV-Fny

7、和cMV-Fny C3F5高所引起。 分別將不同CMV株系的2b基因取代CMV-Fny對應(yīng)部分而構(gòu)建CMV-Fny突變體在心葉煙上癥狀分析的結(jié)果表明：CMV-CB7在心葉煙上引起系統(tǒng)性壞死癥狀是由2b蛋白決定。由于CMV-CB7的2b基因同CMV-35＃的2b同源性最高，因此構(gòu)建2b CB7和2b35＃6個嵌合型的2b基因。含6個嵌合型的2b基因的CMV-Fny突變體的活性分析表明：CMV-CB7的2b蛋白第52和55位的亮氨酸

8、引起心葉煙系統(tǒng)性壞死癥狀。 3．決定黃瓜花葉病毒satRNA在煙草上高含量積累的位點(diǎn)研究 通過RT-PCR分別在CMV侵染的番茄和白菜中分別獲得兩個satRNA(Yi-satRNA，Ynl2-satRNA)，Yi-satRNA分子大小為387 nt和Ynl2-satRNA分子大小為385 nt。兩個satRNA有3處堿基差異，分別為第11位，第269位和第367-369位。 CMV-Fny均能支持Yi-satRNA和Ynl2

9、-satPNA在煙草上高含量積累；而以 CMV-CB7為輔助病毒，dsRNA檢測結(jié)果顯示：在煙草寄主上，Yi-satRNA高豐度積累，而無Ynl2-satRNA積累。Yi-satRNA和Ynl2-satRNA對CMV-CB7基因組在煙草積累量分析結(jié)果表明：CMV-CB7攜帶上Yi-satRNA后，其RNA1，RNA2，RNA3和RNA4大大降低，僅為單獨(dú)接種CMV-CB7的RNA1，RNA2， RNA3和RNA4的12.7％，6.0％，

10、11.1％和15.8％，而Ynl2-satRNA對CMV-CB7基因組的積累量幾乎無影響。因此CMV-CB7攜帶Yi-satRNA后其癥狀減輕是由于該satRNA降低了CMV-CB7的基因組積累量所引起。 Yi-satRNA和Ynl2-satRNA第11位、第269位和第367-369位定點(diǎn)互補(bǔ)突變結(jié)果表明：以CMV-CB7為輔助病毒，Yi-satRNA第11位A、第269位A不影響其在煙草高含量積累特性，而第367-369位UAU突變

11、為AAA，在寄主中 Northern blot檢測不到Y(jié)i-satRNA分子，因此第367-369位UAU是決定 Yi-satRNA高含量積累量的位點(diǎn)。Ynl2-satRNA第11位和第367-369位突變成 Yi-satRNA位點(diǎn)后，Ynl2-satRNA均能在寄主上高含量積累。CMV-Fny與 CMV-CB7的6個假重組病毒與Ynl2-satRNA共同接種于煙草上，RT-PCR分析結(jié)果表明：F1C2C3、F1F2C3和F1C2F3能

12、作為Ynl2-satRNA輔助病毒，而其它3個則檢測不到satRNA分子。因此Ynl2-satRNA以CMV-CB7為輔助病毒不能在煙草上積累，是由其RNA1決定。 4．黃瓜花葉病毒2b基因?qū)ζ鋝atRNA積累量的影響 以CMV-Fny與Rs-satRNA共同侵染克里夫蘭煙、煙草和本氏煙的總RNA為模板，7dpi和14dpi，Realtime RT-PCR分析Rs-satRNA在3種不同煙草寄主上相對含量，結(jié)果表明：Rs

13、-satRNA含量在煙草中最低，在本氏煙含量最高；在14 dpi，Rs-satRNA在3種寄主上含量升高，在克里夫蘭煙、煙草和本氏煙寄主植株上的相對含量分別為1.54、1.08和3.51。因此以CMV-Fny作為輔助病毒，Rs-satRNA積累量在煙草寄主上的積累量跟寄主的不同品種有關(guān)。CMV-Fny、CMV-Fny2b Phy、CMV-Fny2b 35＃、CMV-Fny2b CB7和CMV-FnyA2b與Rs-satRNA混和分別接種

14、于克里夫蘭煙、煙草和本氏煙，Rs-satRNA在不同寄主上積累量分析結(jié)果表明：CMV-Fny 2b基因缺失(CMV-FnyA2b)對Rs-satRNA在3種寄主植物上的積累量無明顯影響：Rs-satRNA含量在本氏煙中含量最高，克里夫蘭煙次之，而在煙草中積累量最低。CMV-Fny、CMV-Fny2b Phy、 CMV-FnyEb 35＃、CMV-Fny2bM CB7在同一種寄主中，對Rs-satRNA積累量影響無明顯差異，但跟煙草品種有

15、關(guān)。因此Rs-satRNA的積累量跟寄主有關(guān)，不同CMV2b基因?qū)s-satRNA含量影響無明顯差異。 5．SatRNA介導(dǎo)黃瓜花葉病毒在煙草上基因組含量降低與2b相關(guān) CMV-Fny與Rs-satRNA共同接種于煙草，Rs-satRNA能明顯減輕CMV-Fny在寄主植物上癥狀。3、10和21dpi，采用Realtime RT-PCR定量分析Rs-satRNA對CMV-Fny基因組積累量的影響，結(jié)果表明：Rs-satR

16、NA明顯抑制CMV-Fny基因組量的積累。3dpi，CMV-Fny基因1a、2a、2b、3a和CP積累量分別是CMV-Fny加Rs-satRNA的7.6、10.8、9.8、9.7和5.8倍；10dpi，CMV-Fny基因1a、2a、2b、3a和CP積累量分別比CMV-Fsat 1a、2a、2b、3a和CP高2.6、5.28、10.8、1.4和2.1倍；21 dpi，CMV-Fsat 1a、2a、2b、3a和CP分別為CMV-Fny 1a

17、、2a、2b、3a和CP的62.5％、47.6％、34.5％、30.3％和52.6％。在CMV-Fny和CMV-Fsat接種寄主的新長葉中，CMV-Fny 1a、2a、2b、3a和CP分別是CMV-Fsat的1.6、24.3、37.6、3.9和7.0倍。因此，Rs-satRNA對CMV-Fny 2b基因積累量抑制效應(yīng)相對明顯。CMV-FnyA2b在煙草上癥狀明顯比野生型CMV-Fny弱，接種植株僅表現(xiàn)輕花葉癥狀，與CMV-Fsat所產(chǎn)生