1、目的：本文采用酵母雙雜交方法，尋找近日節(jié)律系統(tǒng)中的核心分子PERIODl的相互作用蛋白，并研究其作用分子RACKl在近同節(jié)律分子振蕩機(jī)制中的作用。包括二部分：1、酵母雙雜交篩選近同節(jié)律蛋白PERl-PAS結(jié)構(gòu)域的相互作用蛋白：2、RACK1的近同節(jié)律相關(guān)研究。方法： 實(shí)驗(yàn)一：酵母雙雜交篩選PERl-PAS結(jié)構(gòu)域的相互作用蛋白將PERl蛋白PAS結(jié)構(gòu)域的編碼序列定向克隆入pGBKT7誘餌質(zhì)粒中構(gòu)建hPerI一PAS/pGBKT7

2、重組誘餌質(zhì)粒，并通過同源重組的方式構(gòu)建人腦cDNA文庫，采用順序轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)，繼而檢測報告基因表達(dá)篩選陽性克隆，PCR擴(kuò)增陽性克隆文庫質(zhì)粒內(nèi)的插入片段，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PERl新的相互作用分子，最后采用體外轉(zhuǎn)錄、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛋白間相互作用。 實(shí)驗(yàn)二：RACKl的近日節(jié)律功能研究采用PMA體外誘導(dǎo)小鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞的節(jié)律基因表達(dá)，半定量RT-PCR方法檢測編碼RACKl的Gnb2ll，mRNA的變

3、化規(guī)律；12D／12L光暗循環(huán)以及全黑條件下記錄BALB／C小鼠的自發(fā)性轉(zhuǎn)輪運(yùn)動，半定量RT-PCR方法檢測小鼠腦內(nèi)Gnb2ll mRNA的變化規(guī)律；采用能導(dǎo)致行為節(jié)律位相移動的光脈沖刺激DD條件下的小鼠，觀察立早基因Gnb2ll的光敏感性反應(yīng)。免疫組化檢測PERl蛋白表達(dá)不同時相的RACKl分布改變。 實(shí)驗(yàn)一：采用定向克隆方法構(gòu)建了hPerl-PAS/pGBK7重組誘餌表達(dá)質(zhì)粒，同源重組構(gòu)建了腦cDNA/pGADT7一Re

4、c文庫，并通過順序轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建了酵母雙雜交系統(tǒng)。采用營養(yǎng)缺陷篩選以及β-半乳糖苷酶檢測驗(yàn)證陽性克隆轉(zhuǎn)化子內(nèi)報告基因的表達(dá)，最終得到28個陽性克隆。PCR擴(kuò)增陽性克隆轉(zhuǎn)化子內(nèi)的插入片段，篩選得到了編碼人RACKl蛋白碳端部分氨基酸的陽性克隆，體外轉(zhuǎn)錄翻譯PERl-PAS／BD誘餌融合蛋白和RACK1 <,131-306／AD文庫融合蛋白，免疫共沉淀驗(yàn)證了蛋白間的特異性相互作用。 實(shí)驗(yàn)二：對Gnb2l1體內(nèi)的表達(dá)研究證實(shí)，在光線

5、誘導(dǎo)(12D／12L光暗循環(huán))或全黑情況下，BALB／C小鼠腦(Gnb2l，mRNA水平均呈現(xiàn)近日節(jié)律性波動。體外采用PMA(100nM)成功誘導(dǎo)了NIH3T3細(xì)胞的鐘基因近日節(jié)律振蕩，并發(fā)現(xiàn)了Gnb2l1mRNA的近日節(jié)律振蕩。引起行為節(jié)律位相移動的光脈沖刺激誘導(dǎo)了Gnb2L1的光敏感性立早表達(dá)。免疫組化顯示PER．1的高表達(dá)伴隨RACK．1由散布胞漿到聚集于核周的細(xì)胞分布改變。結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了酵母雙雜交系統(tǒng)，并篩