1、卵菌是一類真核生物，包括許多重要的植物和動物痛原菌。其中疫霉屬包含許多引起作物毀滅性病害的病原菌，如19世紀(jì)中葉危害馬鈴薯引起愛爾蘭大饑饉的致病疫霉(Phytophthora infestans(Montagne)de Bary)，引起大豆疫霉根腐病且平均每年給全世界大豆生產(chǎn)造成約10-20億美元的經(jīng)濟(jì)損失的大豆疫霉(Phytophthora sojaeKaufman&Gerdman)等。迄今為止，由于對疫霉菌致病機(jī)制方面的了解匱乏，使

2、得作物疫病一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個威脅。對大豆疫霉全基因組進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其基因組中編碼近400個RxLR類效應(yīng)分子，相比于其他植物病原菌，如此數(shù)量龐大的效應(yīng)分子家族暗示了寄主植物和疫霉菌之間存在復(fù)雜的防衛(wèi)/反防衛(wèi)關(guān)系。盡管一些效應(yīng)分子已被發(fā)現(xiàn)能夠抑制植物的防衛(wèi)反應(yīng)，但絕大部分效應(yīng)分子在侵染過程中的毒性功能及其作用機(jī)制仍然未知。
　　RNA沉默(RNA silencing)是植物、真菌以及無脊椎動物等抵御病毒侵染的重要機(jī)制。病

3、毒通過編碼RNA沉默抑制子(Viral Suppressors of RNA silencing，VSRs)能夠抑制寄主的基因沉默，幫助病毒侵染。由small RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-Transcriptional Gene Silencing, PTGS)是寄主抵御細(xì)菌的重要機(jī)制，并且發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中一些效應(yīng)分子也能作為RNA沉默抑制子(BSRs)來抑制寄主的基因沉默。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)大豆疫霉兩個RxLR效應(yīng)分子是植物RNA沉默抑

4、制子，分別命名為PSR1和PSR2(Phytophthora Suppressors of RNA silencing1 and2)，且具有不同的抑制沉默機(jī)制。
　　本論文主要對P.sojae PSR2(PsPSR2)效應(yīng)分子及其同源效應(yīng)分子的功能進(jìn)行深入分析，獲得了如下研究結(jié)果:
　　1.PsPSR2-like基因在疫霉菌中的生物信息學(xué)鑒定與進(jìn)化分析。分析了8個疫霉物種（大豆疫霉(P.sojae），辣椒疫霉(Phytoph

5、thora capsici)，致病疫霉(P.infestans)，寄生疫霉(Phytophthora parasitica)，橡樹疫霉(Phytophthora ramorum)，樟疫霉刺槐變種(Phytophthora cinnamomi var.robiniae)，瓜類疫霉(Phytophthora melonis)和荔枝疫霉(Phytophthora litchi)的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)在所檢測的每個疫霉物種中均存在PsPSR2-l

6、ike基因，這在具有豐富多態(tài)性的RxLR效應(yīng)分子家族中是罕見的。所有這些PsPSR2-like基因編碼的蛋白都含有保守的N端信號肽和RxLR序列元件，表明它們都是胞內(nèi)效應(yīng)分子，且在活體營養(yǎng)型卵菌Hyaloperonospora arabidopsidis也發(fā)現(xiàn)一個PsPSR2-like基因，含有保守的N端信號肽和dEER-like序列元件，以上強(qiáng)有力地說明RxLR效應(yīng)分子PsPSR2廣泛分布于疫霉屬，且有可能分布于其他卵菌病原菌中。Ps

7、PSR2-like基因分為三個系統(tǒng)進(jìn)化分枝，這與基于ITS序列建立的疫霉的物種進(jìn)化分化樹是高度一致的，說明PsPSR2-like效應(yīng)分子在進(jìn)化上是高度保守的，并且和疫霉物種分化是同步的。多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)PsPSR2在大豆疫霉的四個主要生理小種(Race2、Race7、Race17和Race19)的代表性菌株間沒有多態(tài)性。并且對PsPSR2的結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)它含有5個串聯(lián)的L-W-Y復(fù)合體結(jié)構(gòu)，并且在PsPSR2-like基因中也大都有這樣重

8、復(fù)排列結(jié)構(gòu)，且W-Y結(jié)構(gòu)被證明與α-螺旋折疊相關(guān)，說明PsPSR2可能通過形成這些重復(fù)結(jié)構(gòu)，使蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜化來逃避寄主的識別。
　　2.PsPSR2效應(yīng)分子的毒性功能研究。前期已有研究表明大豆疫霉PsPSR2效應(yīng)分子能抑制植物RNA沉默反應(yīng)，這種抑制作用與大豆疫霉侵染能力是否存在關(guān)聯(lián)值得研究。在大豆疫霉中瞬時沉默PsPSR2，發(fā)現(xiàn)大豆疫霉對大豆下胚軸的侵染能力顯著減弱，表明PsPSR2是一個毒性因子。接著我們用大豆疫霉菌株P(guān)649

9、7的GFP轉(zhuǎn)化菌株監(jiān)控觀察大豆疫霉侵染大豆根系的過程，經(jīng)實(shí)時定量檢測發(fā)現(xiàn)PsPSR2主要在侵染后期即菌絲擴(kuò)展和卵孢子形成階段高度上調(diào)表達(dá)。定位觀察發(fā)現(xiàn)PsPSR2主要定位在煙草細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中。隨后，由發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)在大豆中瞬時表達(dá)PsPSR2，發(fā)現(xiàn)表達(dá)PsPSR2的大豆發(fā)狀根對大豆疫霉更加感病。先前研究證明表達(dá)PsPSR2擬南芥植株中與植物抗病反應(yīng)相關(guān)的ta-siRNA的生物合成受到抑制，但是PsPSR2是否促進(jìn)病原菌對擬南芥的

10、侵染還不清楚，因此，我們成功建立了擬南芥與辣椒疫霉的親和互作體系，并發(fā)現(xiàn)ta-siRNA合成受抑的PsPSR2-5和PsPSR2-10轉(zhuǎn)基因擬南芥株系對辣椒疫霉更為敏感，但ta-siRNA合成正常的PsPSR2-18株系對辣椒疫霉的敏感性沒有顯著變化，說明PsPSR2可能通過與特定的ta-siRNA結(jié)合來抑制RNA沉默，從而促進(jìn)疫霉的侵染。此外，我們還發(fā)現(xiàn)PsPSR2轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中PR1基因表達(dá)受抑制，說明PsPSR2促進(jìn)侵染還可能

11、是通過干擾植物中依賴于水楊酸的防衛(wèi)途徑。綜上所述，PsPSR2效應(yīng)分子可通過抑制寄主植物（大豆、擬南芥等）的RNA沉默途徑及與其他防衛(wèi)途徑相互作用來發(fā)揮毒性功能。
　　3.PsPSR2-like基因的功能分析研究。PsPSR2在疫霉屬中的廣泛分布性以及進(jìn)化上的保守性，促使我們想了解它們的功能是否也保守。我們通過生物信息學(xué)分析選取了6個PsPSR2同源基因來鑒定它們的RNA沉默抑制活性，結(jié)果表明致病疫霉中與PsPSR2親緣關(guān)系最近的

12、PITG_15152同樣能夠抑制植物內(nèi)的RNA沉默效應(yīng)，且抑制程度強(qiáng)于PsPSR2。該蛋白在結(jié)構(gòu)上僅比PsPSR2相差一個L-W復(fù)合體，亞細(xì)胞定位及在侵染階段的表達(dá)譜與PsPSR2相似，由此命名為PiPSR2。當(dāng)在致病疫霉中沉默PiPSR2后，沉默轉(zhuǎn)化子在生長及休止孢萌發(fā)率等表型沒有變化，但對本氏煙草的致病力顯著減弱，表明PiPSR2是致病疫霉的一個毒性因子。同時，在煙草中瞬時表達(dá)PiPSR2后，顯著促進(jìn)了致病疫霉菌對煙草的侵染。以上結(jié)

13、果表明PsPSR2-like效應(yīng)分子可能是疫霉菌中一類基本的毒性因子，通過抑制植物的RNA沉默途徑來干擾植物對疫霉菌的抗病性。為了進(jìn)一步研究PiPSR2在抑制RNA沉默反應(yīng)中的具體的作用機(jī)制，我們已經(jīng)成功獲得了PiPSR2的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，為以后的深入研究奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上所述，PsPSR2-like效應(yīng)分子是一類在進(jìn)化上較為保守的RxLR效應(yīng)分子，廣泛分布于整個疫霉屬乃至其他部分植物病原卵菌中，可通過抑制植物體內(nèi)的RNA沉