1、目的：
　　 通過觀察高遷移率族蛋白B1（High mobility group box protein 1，HMGB1)對肝星狀細胞（Hepatic stellate cell，HSC）的激活，以及RAGE在其激活過程中的作用，探討HMGB1對HSC的激活作用及其相關(guān)機制，為肝硬化的防治提供思路和實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 第一部分實驗：HSC 復(fù)蘇后，加DMEM 培養(yǎng)液于37 ℃、5％CO 孵箱中培養(yǎng)，待

2、鋪滿80％后用0.25％胰酶消化，傳代2次至對數(shù)生長期用于實驗。調(diào)整細胞濃度為2～5×10/ml，轉(zhuǎn)至6孔細胞培養(yǎng)板，每孔1ml 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，25細胞單層融合達80％后，換無血清的DMEM培養(yǎng)液孵育2h，使培養(yǎng)細胞均處于G 期用于實驗。實驗分為三組：第一組：對照組（DMEM培養(yǎng)液10ml）；第二組：HMGB1刺激組（HMGB10.1ug/ml）；第三組：HMGB1抗體組（加HMGB1抗體20ug/ml 培養(yǎng)2小時后+HMGB10.

3、1ug/ml）。培養(yǎng)24小時后，采用免疫組化法檢測HSC的α-SMA和TGF-β1的表達，ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清液中HA、PIIIP、CIV和TGF-β1的含量。
　　 第二部分實驗：復(fù)蘇后的HSC 置于DMEM 培養(yǎng)液中，放在37 ℃、5％CO 孵箱中培養(yǎng)，待細胞融合80％后，以0.25％胰蛋白酶消化傳代，以傳至第二代的細胞用于實驗。實驗分為三組：第一組：(A)對照組（DMEM 培養(yǎng)液12ml）；(B)HMGB1刺激組

4、（HMGB10.1ug/ml）；抗RAGE+HMGBl組（加RAGE抗體20ug/ml 2小時后＋HMGB10.1ug/ml）；第二組：(A)對照組（DMEM 培養(yǎng)液1ml）；(B)HMGB1刺激組（HMGB10.1ug/ml）；?sRAGE+HMGBl組（sRAGE 20ug/ml和HMGB10.1ug/ml 混合2小時后加入細胞DMEM 培養(yǎng)液中）；第三組：(A)對照組（DMEM 培養(yǎng)液1ml）；(B)HMGB1刺激組（HMGB10

5、.1ug/ml）；?AGE+HMGB1組（加AGE160ug/ml 2小時后＋HMGB10.1ug/ml）。培養(yǎng)24小時后，采用免疫組化法檢測HSC中α-SMA和TGF-β1的表達，ELISA 檢測細胞培養(yǎng)上清液中HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.HMGB1對HSC 有顯著的激活作用：免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，對照組HSC 未刺激時α-SMA、TGF-β1在細胞質(zhì)中微弱表達；HMGBl 刺

6、激24h后α-SMA、TGF-β1較對照組表達明顯增加(P＜0.05)；加入HMGB1抗體后，α-SMA、TGF-β1在細胞質(zhì)中表達水平與對照組比較無顯著差別(P＞0.05)，但較HMGB1組比較顯著下降(P＜0.05)。未刺激時，細胞培養(yǎng)上清液中HA，PIIIP，CIV和 TGF-β1含量較少；HMGBl 刺激24h后HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量均較對照組明顯增加(P＜0.05)；加入HMGB1抗體后，HA、PIIIP、

7、CIV和TGF-β1含量與對照組無顯著差別(P＞0.05)，但較HMGB1組明顯下降(P＜0.05)。
　　 2.RAGE抗體能抑制HMGB1對HSC的激活作用：免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，在抗RAGE+HMGBl組，HSC細胞質(zhì)中的α-SMA、TGF-β1表達水平較HMGB1組明顯減少(P＜0.05)；ELISA 結(jié)果顯示，抗RAGE+HMGBl組培養(yǎng)液中的HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量較HMGB1組顯著下降(P＜0.0

8、5)；抗RAGE+HMGBl組的免疫細胞化學(xué)和ELISA 結(jié)果雖均較對照組有所增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.sRAGE 可拮抗HMGB1對HSC的激活作用：免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，在sRAGE+HMGBl組，HSC細胞質(zhì)中α-SMA、TGF-β1表達水平較HMGB1組明顯減少(P＜0.05)；ELISA 結(jié)果顯示，sRAGE+HMGBl組培養(yǎng)液中的HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量較HMGB1組顯著

9、下降(P＜0.05)，sRAGE+HMGBl組的免疫細胞化學(xué)和ELISA 結(jié)果雖均較對照組有所增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4.AGE 無阻斷HMGB1對HSC的激活作用：免疫組化結(jié)果顯示，在AGE+HMGB1組HSC細胞質(zhì)中的α-SMA、TGF-β1表達較HMGB1組比較有所增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；
　　 ELISA 結(jié)果顯示，AGE+HMGB1組培養(yǎng)液中的HA、PIIIP、CIV

10、和 TGF-β1含量較HMGB1組比較有所增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。AGE+HMGBl組的免疫組化和ELISA 結(jié)果與對照組比，表達水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.HMGB1可促進α-SMA、TGF-β1在HSC細胞質(zhì)中的表達，增加HA、PIIIP、CIV和TGF-β1的分泌，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用；
　　 2.RAGE抗體和sRAGE能抑制