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![枇杷DNA纖維制備及FibeR-FISH技術體系的建立與應用.pdf_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/11/8/4a455ade-986f-4f40-80b3-c4a60ca22dbd/4a455ade-986f-4f40-80b3-c4a60ca22dbd1.gif)
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文檔簡介
1、DNA纖維熒光原位雜交(Fiber fluorescence in situ hybridization,Fiber-FISH)是一項重要的分子細胞遺傳學研究技術,在染色體高分辨率物理圖譜構建、基因精細定位、基因序列分析以及全基因組測序等方面具有重要的應用價值。本文利用普通二倍體枇杷‘興寧1號’為試驗材料,進行了枇杷DNA纖維制備技術研究,并以SSR標記序列與45SrDNA為探針,開展了枇杷Fiber-FiSH相關技術體系的研究并進行了
2、初步應用,主要結果如下:
(1)進行了枇杷DNA纖維制備技術的摸索,包括細胞核提取方法、試驗材料的選取與DNA纖維伸展等技術要點。對“刀切法”與“液氮研磨法”進行細胞核提取的效果進行了比較,并對枇杷不同發(fā)育時期的黃化子葉為試驗材料進行細胞核提取的效果進行了比較。采用“刀切法”相對于“液氮研磨法”進行細胞核提取效果較好,前者簡便無毒,細胞核完整、無破損,且提取率為100%,后者操作復雜、有毒,且雜質多,細胞核易破損不完整,得
3、率相對較低。通過“刀切法”進行不同發(fā)育時間的黃化子葉提取細胞核的效果比較發(fā)現,發(fā)育4d的黃化子葉提取的細胞核含有雜質,提取效果不好;發(fā)育10d的黃化子葉由于趨于老化且可能腐爛,因此不能提取得到細胞核;發(fā)育7d的黃化子葉提取細胞核效果最好,雜質少、細胞核完整,且提取率為100%。對提取的細胞核濃度進行了比較,發(fā)現取80mg的黃化子葉,加入30μl的細胞核貯存液所獲得的細胞核濃度為5×106-7個/ml,適宜進行DNA纖維的制備,而加入60
4、μl的細胞核貯存液獲得的細胞核濃度則過低,不適宜于DNA纖維的制備。對DNA纖維的伸展方法進行了比較,發(fā)現重力自然拉伸法與載玻片推動涂抹法制備的DNA纖維質量相對較差,重力自然拉伸法制備的DNA纖維,可能會出現DNA纖維交叉、重疊且分布不均勻,而載玻片推動涂抹法則可能會導致DNA纖維交叉、堆積、斷裂與丟失;效果較好的是載玻片前端引流法,這種方法制備的DNA纖維伸展平直、分布均勻、無交叉重疊、無斷裂且較為完整。
(2)以‘大
5、渡河枇杷’SSR標電序列SSR1與SSR2,以及45SrDNA為探針分別進行了中期染色體與DNAFiber上的FISH研究,同時在原有研究基礎上進行了FISH體系的優(yōu)化,并結合這兩種FISH結果進行了比較分析。
FISH體系優(yōu)化主要針對雜交與變性、雜交后洗脫嚴謹度以及雜交信號檢測等技術要點。SSR-FISH與Fiber-FISH流程相同,在45SrDNA-FISH基礎上,第一,嚴格控制變性溫度與時間;第二,雜交后沈脫溫度由
6、37℃降為35℃,洗脫次數由3次降為2次;第三,Anti-Dig-FITC抗體濃度由2μg/ml提高至μg/ml,且反應時間由1h增加至1.5h;另外,DNA纖維襯染時,DAPI濃度由2μg/ml提高至5μg/ml,染色時間由10min增加至20min。
SSR1與SSR2在中期染色體與間期細胞核中均分別檢出2個位于2條染色體且信號強弱相同即均較弱、大小類似且位置相同即均位于近著絲粒區(qū)域的雜交信號,推測可能是1對同源信號;
7、45SrDNA在中期染色體與間期細胞核中檢出了4個雜交信號,其中2個較強、分布區(qū)域較大且位于染色體近端部,另2個相對較弱、分布區(qū)域較小且位于染色體近端部,推測可能為2對同源信號,并推測供目標染色體組發(fā)生了染色體與基因的重組:同時利用原子力顯微鏡進行雜交信號的檢測,獲得了清晰的掃描圖片,確定了信號在中期染色體上的區(qū)域、大小及表面形貌。
SSR1、SSR2與45SrDNA在DNA纖維上均呈現典型的非連續(xù)念珠狀雜交信號,3種探針
8、在DNA纖維上雜交信號的長度分別為15~30μm、20-~35μm、30~45μm,且根據信號的非連續(xù)性與念珠狀認為雜交信號是真實的。
結合SSR1、SSR2與45SrDNA這3種探針在枇杷體細胞中期染色體與DNA纖維上的FISH研究結果,初步總結認為:①SSR1與SSR2探針可清晰準確地定位在中期染色體與DNA纖維上,Fiber-FISH具有更高的分辨率,且認為所用大渡河SSR標記片段在供試‘興寧1號’的2條染色體中可能
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