1、ProsaptideTX14是一種新型的神經營養(yǎng)肽，由鞘脂激活蛋白原具有神經營養(yǎng)活性的序列改造而成，鞘脂激活蛋白原或ProsaptideTX14可以與神經細胞膜上的PT敏感的G受體結合，活化細胞外調節(jié)激酶(ERK)，刺激神經細胞中乙酰膽堿酯酶的活性，促進神經細胞的生長和分化。 由于鞘脂激活蛋白原為新發(fā)現(xiàn)的神經營養(yǎng)因子，除了其神經營養(yǎng)活性之外，在外圍組織的廣泛分布，提示ProsaptideTX14可能還有其它生物活性。因此，進一

2、步深入探討ProsaptideTX14的生物活性及其可能的分子機制，將為研究開發(fā)其潛在的臨床應用價值奠定基礎?；蚬こ碳夹g是制備短肽的一種行之有效的方法，我們將利用Prosaptide的氨基酸序列合成目的基因，以串聯(lián)連接方式得到多拷貝的目的片段，采用原核表達的方法高效的制備神經營養(yǎng)肽NP14，進而研究其生物活性。實驗的主要內容為： [目的] 采用基因工程的方法制備神經營養(yǎng)肽NP14。 [方法] 1

3、.NP14基因來源于ProsaptideTX14的14個氨基酸，它的第一個氨基酸由蘇氨酸改為絲氨酸，然后，通過PCR串聯(lián)成雙拷貝基因2NP，在小肽NP14兩端各引進一個蛋氨酸，從而建立了蛋白裂解位點。 2.通過堿性磷酸酶的脫磷酸反應處理的載體pUC18與雙拷貝基因2NP片段做平端連接，構建了克隆載體pUC18-2NP。 3.通過藍白斑篩選得到的重組陽性克隆pUC18-2NP在大腸桿菌JM109中增殖后，經質粒的提取，

4、EcoT14I的酶切，鑒定出陽性重組子。經測序鑒定證實2NP片段確已插入載體。 4.經EcoT14I酶切pUC18-2NP產生出大量帶有粘性末端的2NP片段，通過自身連接獲得多拷貝串聯(lián)體。 5.多拷貝基因被構建到來源于質粒pET32a(+)的質粒pETEcoT中，在pET32a(+)的多克隆位點引進限制性內切酶EcoT14I識別序列CCAAGG，利用其酶切后可產生非鏡相對稱粘性末端，一次連接反應就構建出一系列不同基因

5、拷貝數(shù)的表達載體。這樣表達出的融合蛋白即可被溴化氫剪切出不殘留任何外源氨基酸的單肽。 6.采用多種篩選方法鑒定多拷貝陽性克隆，最終通過PCR-array法篩選到多拷貝陽性克隆。 7.多拷貝基因與硫氧還原蛋白TrxA融合表達。不同拷貝數(shù)的小肽融合蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中均獲得高效表達。 [結果] 我們根據ProsaptideTX14合成了雙拷貝基因2NP，通過平端連接構建了神經營養(yǎng)肽NP1