1、克服衰老一直是人類的最大夢想之一。機體衰老除了各器官組織結構和功能衰退，適應性和抵抗力降低以外，還會引發(fā)各種衰老相關的疾病，如糖尿病、帕金森癥、阿爾茨默海氏癥以及各種癌癥等。目前對于衰老方面的通路研究，還有許多不明確的地方。SWI/SNF復合物是一類染色質重塑復合物家族蛋白，它由多個亞基構成，依賴ATP水解釋放的能量來改變染色質結構，轉錄激活或轉錄抑制下游因子的表達。人類的SWI/SNF蛋白質家族在細胞周期的過程中發(fā)揮基礎性的作用，如D

2、NA復制，生長，分化，延伸，剪接以及DNA損傷的修復。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，SWI/SNF復合物亞基，主要是催化亞基BRG1還參與調控細胞衰老過程，但對于其他亞基在衰老調控中的作用和相關機制還幾乎沒有具體研究。在本文中，我們采用濃度為150μM的過氧化氫處理人表皮永生化細胞HaCaT和人黑色素瘤細胞GLL19,處理時間為1小時，構建衰老模型，并在此模型基礎上篩選衰老處理前后差異表達的SWI/SNF復合物亞基。然后分別在兩種細胞中過表達和沉默

3、篩選出的三個亞基，通過SA-β-gal染色、細胞增殖測定、細胞周期測定及衰老相關因子表達檢測來探究SWI/SNF復合物亞基參與細胞衰老調控和可能的機制。為衰老相關通路研究及相關的臨床治療應用打下基礎。主要實驗結果如下：
　?、儆脻舛葹?50μM的H2O2處理細胞1小時，然后繼續(xù)培養(yǎng)4天，然后用形態(tài)學觀察、SA-β-gal染色、MTT測定增殖和流式細胞術檢測細胞周期來確認衰老表型。結果顯示，H2O2處理4天后，細胞形態(tài)變得大而扁平，

4、邊界模糊，呈衰老樣形態(tài)，SA-β-gal染色大部分呈陽性，細胞增殖明顯受到抑制，細胞發(fā)生顯著的G2期細胞周期阻滯。
　?、谟冒攵縍T-PCR的方法來篩選H2O2處理前后差異表達的SWI/SNF復合物亞基，并用Western Blot確認篩選出的亞基的在蛋白水平變化。結果顯示：H2O2處理后，BAF57、BAF60a、SNF5和BRG1四個亞基基因水平表達上調，由于已有研究表明BRG1在細胞衰老中的作用，所以選取BAF57、BAF

5、60a、SNF5進行進一步研究。Western Blot結果確認BAF57、BAF60a、SNF5在H2O2處理后蛋白水平表達上調。
　?、墼趐cDNA-EGFP上構建過表達重組質粒pc-BAF57、pc-BAF60a和pc-SNF5，將重組載體轉入細胞中，并用半定量RT-PCR和Western Blot確認重組質粒成功轉入細胞中并表達，然后用SA-β-gal染色、MTT測定增殖、流式細胞術檢測細胞周期。結果顯示：重組質粒構建成功

6、，并且在細胞中高表達。轉染了pc-BAF57、pc-BAF60a和pc-SNF5的細胞SA-β-gal未見明顯陽性染色，但是細胞增殖受到明顯抑制，發(fā)生顯著的S期細胞周期阻滯。表明BAF57、BAF60a、SNF5單獨過表達并不能觸發(fā)細胞衰老，但是會引起明顯的細胞周期停滯。
　?、躶iRNA轉染沉默BAF57、BAF60a、SNF5的表達，再用H2O2處理，通過SA-β-gal染色和細胞周期測定來檢測預先沉默三個亞基對H2O2處理誘

7、導衰老的影響。結果表明：預先單獨沉默BAF57、BAF60a、SNF5的表達后，SA-β-gal染色陽性細胞數(shù)目減少，細胞周期阻滯現(xiàn)象有所緩解。表明沉默三個亞基后，一部分細胞繞過了衰老途徑。
　　⑤用半定量RT-PCR對轉染pc-BAF57、pc-BAF60a和pc-SNF5后衰老相關因子進行檢測，然后再用Western Blot檢測沉默BAF57、BAF60a、SNF5，再用H2O2處理后細胞衰老相關因子的蛋白表達水平變化。結果