1、研究背景和目的：
　　高強度聚焦超聲(HIFU)是一種新興的治療實體腫瘤的非侵入性技術。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，HIFU不僅能夠破壞原發(fā)腫瘤、減少遠處轉移，還能增強機體抗腫瘤免疫。但是，其機制尚未闡明。
　　microRNAs(miRNAs)是一類內源性非編碼RNA，通過與目標mRNA的3'UTR序列互補配對，調控靶基因的表達或翻譯，參與生物體的各種生命活動。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs參與免疫細胞的分化、增殖及激活過程，在機

2、體的免疫應答與免疫耐受中均起著十分重要的作用。因此，我們假設 miRNAs參與HIFU增強抗腫瘤免疫的作用，并基于文獻篩選出8個與免疫密切相關的miRNAs作為研究對象，包括miR-34,miR-106a,miR-126a,miR-134,miR-155,miR-181a,miR-221和miR-222；構建HIFU輻照黑色素瘤的小鼠模型，在驗證HIFU增強機體抗腫瘤免疫后，通過qRT-PCR、生物信息學、熒光素酶報告試驗等多種方法篩選

3、、鑒定HIFU處理引起的脾臟及黑色素瘤組織或細胞中差異表達的miRNAs，分別探討它們在HIFU增強小鼠抗黑色素瘤免疫中的作用及機制，為進一步闡明HIFU增強機體抗腫瘤免疫的機制和促進 HIFU在黑色素瘤的臨床治療中的應用提供實驗和理論依據(jù)。
　　實驗方法：
　　1.構建HIFU輻照黑色素瘤的小鼠模型及觀察HIFU增強機體抗腫瘤免疫的作用
　　1）構建C57BL/6J小鼠黑色素瘤B16的皮下移植瘤模型，隨機分HIFU組

4、與假照組，HIFU組用9.3MHz、4.5W的HIFU腫瘤治療系統(tǒng)進行治療，假照組進行假照處理，后續(xù)處理如下：
　?。?）取輻照后即刻的腫瘤組織，包埋、切片及HE染色，觀察輻照靶區(qū)消融效果；
　?。?）輻照7天后，尾靜脈注射B16單細胞懸液200ul(1×106個細胞）/鼠，繼續(xù)飼養(yǎng)至自然死亡。期間，監(jiān)測瘤體體積；死后計數(shù)肺部腫瘤轉移結節(jié)及計算累積生存率；
　?。?）輻照后14天，用qRT-PCR檢測外周血中黑色素瘤細

5、胞標志物MAGE和Melan-A的mRNA，ELISA檢測小鼠血清中的IFN-γ及TNF-α。
　　2）將HIFU組與假照組小鼠的脾淋巴細胞分別與B16細胞共培養(yǎng)，采用細胞毒性試驗檢測脾淋巴細胞對B16細胞的殺傷活性，ELISA檢測共培養(yǎng)上清中的IFN-γ及TNF-α。
　　2.HIFU引起的脾組織中差異表達的microRNAs的篩選及靶基因鑒定
　　1）qRT-PCR檢測HIFU組與假照組的脾組織中的差異miRNAs

6、。
　　2）用生物信息學方法預測差異miRNAs的潛在靶基因。
　　3）RT-PCR及Western blot驗證脾組織中miRNAs潛在靶基因的表達。
　　4）構建熒光素酶報告質粒，驗證差異miRNAs與潛在靶基因之間的直接調控關系。
　　5）將差異miRNAs的mimics轉染脾淋巴細胞，用RT-PCR及Western blot檢測其靶基因的變化，以進一步確認其對靶基因表達的調控。
　　3.HIFU引起

7、的黑色素瘤組織及細胞中差異表達的microRNAs的篩選、靶基因鑒定及其在HIFU增強抗黑色素瘤免疫中的作用及機制探討
　　1）qRT-PCR檢測HIFU組與假照組腫瘤組織中的差異miRNAs。
　　2）用生物信息學方法預測差異miRNAs的潛在靶基因，通過RT-PCR及Western blot驗證腫瘤組織中靶基因的表達。
　　3）構建熒光素酶報告質粒，驗證差異miRNAs對潛在靶基因的直接調控作用。
　　4）再

8、將差異miRNAs的mimics轉染B16細胞，RT-PCR及Western blot檢測其靶基因的變化，以進一步確認差異其對靶基因表達的調控。
　　5）采用HIFU腫瘤治療系統(tǒng)輻照B16細胞：
　?。?）檢測輻照后B16細胞中差異表達miRNA及靶基因的水平。
　?。?）共培養(yǎng)輻照后的B16細胞與B16細胞預激活的脾淋巴細胞，采用細胞毒試驗檢測脾淋巴細胞對B16細胞的殺傷活性，ELISA檢測共培養(yǎng)上清中的IFN-γ及

9、TNF-α。
　　6）用siRNA干擾B16細胞中差異miRNA的靶基因表達，再進行HIFU輻照；輻照后的B16細胞與激活的脾淋巴細胞共培養(yǎng)，細胞毒性試驗檢測脾淋巴細胞對B16細胞的殺傷活性。
　　實驗結果
　　1.HIFU能有效治療黑色素瘤，并提高機體抗黑色素瘤的免疫力。
　　1)HIFU輻照立即引起靶區(qū)腫瘤組織發(fā)生凝固性壞死；輻照11天后，HIFU組瘤體體積開始小于假照組，且隨飼養(yǎng)時間延長，其統(tǒng)計學差異更加明

10、顯；HIFU組肺部腫瘤轉移結節(jié)明顯少于假照組（P<0.01），累積生存率明顯高于假照組（P<0.01）。
　　2)輻照14天后，HIFU組外周血中黑色素瘤細胞標志物 MAGE和Melan-A的mRNA水平明顯降低（P<0.01）；免疫效應因子IFN-γ的水平增加（P<0.05），TNF-α也呈增加趨勢（P>0.05）。
　　3)HIFU輻照增強脾淋巴細胞對 B16細胞的殺傷活性（P<0.05），增加脾淋巴細胞與 B16細胞共

11、培養(yǎng)上清中的IFN-γ（P<0.05）及TNF-α（P>0.05）的水平。
　　2．HIFU輻照能夠下調脾臟中miR-181a的表達，并因此上調免疫共刺激分子ICAM-1的表達。
　　1）HIFU組小鼠脾組織中miR-181a的水平明顯低于對照組（P<0.01）。
　　2)用生物信息學方法預測出共刺激分子ICAM-1是miR-181a的潛在靶基因。
　　3）HIFU組脾組織中ICAM-1的mRNA（P<0.01）

12、和蛋白質（P<0.01）均明顯高于對照組。
　　4)miR-181a mimics顯著抑制pLUC-ICAM-1-3ˊUTR報告質粒中熒光素酶的活性（P<0.01），并下調脾淋巴細胞中ICAM-1的mRNA（P<0.05）和蛋白質的表達（P<0.01）。證明miR-181a負調控ICAM-1。
　　3.HIFU輻照通過抑制B16黑色素瘤細胞中miR-134對CD86表達的負向調控作用，從而增強抗黑色素瘤的免疫效應。
　

13、　1)HIFU組腫瘤組織中miR-134（P<0.01）和miR-222（P<0.01）明顯低于對照組。
　　2)用生物信息學方法預測出CD86和ICAM-1分別是miR-134和miR-222的潛在靶基因。
　　3）HIFU組腫瘤組織中：
　?。?）CD86的mRNA（P<0.05）和蛋白質（P<0.05）高于對照組；
　?。?）ICAM-1的mRNA（P<0.01）和蛋白質（P<0.01）明顯高于對照組。

14、r>　　4）miR-134 mimics顯著抑制pLUC-CD86-3ˊUTR報告質粒的熒光素酶活性，并下調B16細胞中CD86的mRNA（P<0.05）和蛋白質（P<0.05）；但，miR-222不能抑制pLUC-ICAM-1-3ˊUTR報告質粒的熒光素酶活性。提示miR-134負調控CD86，miR-222對ICAM-1無調控作用。
　　5) HIFU輻照的B16細胞中miR-134的水平降低，CD86的水平增加，且miR-1

15、34與CD86呈負相關。
　　6）將HIFU輻照后的B16細胞與正常脾淋巴細胞（已用B16細胞激活）進行體外共培養(yǎng)24 h和48 h后：
　?。?）HIFU組B16細胞存活率明顯低于對照組(P<0.05)；
　?。?）HIFU組共培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α高于對照組，且隨著輻照時間的增加而增加（P<0.05）。
　　7) CD86 siRNA增加B16細胞的存活率（P<0.01）。提示CD86的下調可抑制脾

16、淋巴細胞對B16細胞的殺傷活性，
　　結論：
　　1.HIFU輻照能夠使靶區(qū)腫瘤組織發(fā)生凝固型壞死、抑制腫瘤生長和遠處轉移，提高宿主生存率，增強機體抗腫瘤免疫。
　　2.HIFU輻照通過抑制腫瘤組織中miR-134對共刺激分子CD86的負調控作用，從而增強其抗腫瘤免疫。
　　3.HIFU輻照可以抑制脾組織中miR-181a對共刺激分子ICAM-1的負調控作用，這可能是HIFU輻照增強抗腫瘤免疫的機制之一。