1、背景:骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）是全球第四大危害人類健康的疾病，主要表現(xiàn)為漸進性的骨量丟失（bone loss）和骨骼脆性（skeleton fragility）增加。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與發(fā)展通常沒有明顯的癥狀（symptom），一般是在體格檢查或者并發(fā)癥發(fā)生時才被發(fā)現(xiàn)。脆性骨折（fragility fracture）是骨質(zhì)疏松癥的最主要、也是最嚴重的并發(fā)癥之一，有近一半的骨質(zhì)疏松患者曾至少發(fā)生過一次脆性骨折。長骨和中心骨的骨

2、折常導致患者行動不便、癱瘓甚至死亡，給家庭、社會帶來巨大的經(jīng)濟與精神負擔。因此，骨質(zhì)疏松的早期診斷對于預防嚴重的骨量丟失和脆性骨折是至關重要的。目前，臨床診斷骨質(zhì)疏松癥的金標準（gold standard）是基于雙能X線掃描術（dual energy X-ray absorptiometry，DXA）的骨密度檢測。然而，較高的價格、不可移動性以及潛在的輻射危險都限制了DXA在臨床中的應用。所以，探索一種靈敏性高、特異性強、方便性佳的骨質(zhì)

3、疏松診斷技術對于骨質(zhì)疏松的防治是必要的。
　　循環(huán)microRNA（circulating microRNA）是一種存在于體液中的微小RNA，在體內(nèi)能夠特異性表達，在體外能夠長時間穩(wěn)定存在。與傳統(tǒng)血清學標志物相比，循環(huán)microRNA具有靈敏性高、特異性強、穩(wěn)定性好等多種優(yōu)勢。研究表明，循環(huán)microRNA表達的異常與疾病的病理生理進程具有高度的相關性，因此具有作為分子診斷標志物的巨大潛力。目前，循環(huán)microRNA作為分子標志物

4、，已在腫瘤及全身多系統(tǒng)疾病中表現(xiàn)出了較好的診斷效能（diagnostic performance）。雖然有研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)microRNA在骨質(zhì)疏松和其它骨骼疾病中的表達譜異常，但是，循環(huán)microRNA在骨質(zhì)疏松癥中的診斷作用及效能的評價有待研究。
　　目的:本研究試圖通過高通量microRNA芯片研究、大樣本量訓練研究、獨立驗證研究以及動物模型研究等序列研究，探索骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中循環(huán)microRNA表達譜的變化，明確循環(huán)micr

5、oRNA在骨質(zhì)疏松診斷中的作用及診斷效能，為骨質(zhì)疏松的分子生物學診斷提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.樣本代表性的評價。利用構成比分析法、箱狀圖分析法及相關性分析法等統(tǒng)計學方法對生物樣本庫中樣本的基本信息、骨密度、T值等臨床資料進行分析，與全國骨質(zhì)疏松流行病學調(diào)查結果進行比對，明確樣本的代表性。
　　2.差異性表達的循環(huán)microRNA的初步篩選。將各組樣本等比例混樣，利用高通量microRNA芯片檢測技術篩選骨量正

6、常、骨量降低、骨質(zhì)疏松三者間差異性表達的循環(huán)microRNA。并通過表達量、變化趨勢以及保守性等標準進一步篩選microRNA。
　　3.循環(huán)microRNA在診斷骨質(zhì)疏松中作用及效能的評價。利用實時定量RT-PCR技術對骨量正常、骨量降低、骨質(zhì)疏松樣本（共288例）的循環(huán)microRNA表達量進行檢測。通過箱狀圖分析法、受試者工作特征曲線分析法明確循環(huán)microRNA在三組樣本中的變化趨勢，以及對骨質(zhì)疏松的診斷效能。
　　

7、4.聯(lián)合診斷模型的建立及評價。通過Logistic regression模型篩選對聯(lián)合診斷模型有顯著貢獻的microRNA，并建立基于Logistic regression方程和簡單線性方程的聯(lián)合診斷模型。通過箱狀圖分析法、受試者工作特征曲線分析法明確循環(huán)microRNA在三組樣本中的變化趨勢，以及對骨質(zhì)疏松的診斷效能。通過與傳統(tǒng)骨轉換標志物的比較，明確基于循環(huán)microRNA的聯(lián)合診斷模型的優(yōu)勢。
　　5.循環(huán)microRNA及

8、聯(lián)合診斷模型在診斷骨質(zhì)疏松中作用及效能的獨立驗證。利用實時定量RT-PCR技術對骨量正常、骨量降低、骨質(zhì)疏松樣本（共160例）的循環(huán)microRNA表達量進行檢測。通過箱狀圖分析法、受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC curve）分析法驗證循環(huán)microRNA及聯(lián)合診斷模型在三組樣本中的變化趨勢，以及對骨質(zhì)疏松的診斷效能。通過與傳統(tǒng)骨轉換標志物的比較，驗證基于循環(huán)m

9、icroRNA的聯(lián)合診斷模型的優(yōu)勢。
　　6.循環(huán)microRNA在骨質(zhì)疏松預警及療效監(jiān)測中的作用及評價。通過建立衰老模型、卵巢切除模型及細胞治療模型模擬人類骨質(zhì)疏松和抗骨質(zhì)疏松治療。利用microCT掃描技術對不同年齡小鼠、卵巢切除后不同時間的大鼠、細胞治療后大鼠的骨密度進行檢測。利用實時定量RT-PCR技術對動物模型的循環(huán)microRNA表達量進行檢測。通過箱狀圖分析法、受試者工作特征曲線分析法明確循環(huán)microRNA的變化趨

10、勢及診斷效能，明確循環(huán)microRNA在骨質(zhì)疏松預警、療效檢測方面的作用。
　　結果:
　　1.生物樣本庫中共納入了678例樣本，骨質(zhì)疏松樣本在總樣本中、男性樣本中、女性樣本中所占比例與全國骨質(zhì)疏松流行病學調(diào)查的結果相近；骨密度與年齡、身高、體重、BMI等具有一定的相關性，與全國骨質(zhì)疏松流行病學調(diào)查結果一致。
　　2.通過高通量microRNA芯片及納入標準，篩選出22個在骨量正常、骨量降低、骨質(zhì)疏松中漸變性、差異性表

11、達的循環(huán)microRNA，其中13個呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，9個呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。
　　3.通過大樣本量訓練研究，進一步篩選出10個在骨量正常、骨量降低、骨質(zhì)疏松中漸變性、差異性表達的microRNA。這10個microRNA能夠單獨診斷骨質(zhì)疏松，但曲線下面積（AUC）、靈敏性、特異性及準確性均不理想。
　　4.成功建立了聯(lián)合診斷模型。與單個循環(huán)microRNA相比，聯(lián)合診斷模型診斷骨質(zhì)疏松的曲線下面積（AUC）、靈敏性、特異性及準確性均

12、大幅提升?；贚ogistic regression方程建立的Index1的診斷效能高于基于簡單線性方程建立的Index2。與血清tPINP和β-CTx相比，Index1的診斷效能明顯升高；三者聯(lián)合診斷模型Index1+P+C的診斷效能并不優(yōu)于Index1。
　　5.通過獨立驗證研究，確認了單個循環(huán)microRNA能夠單獨診斷骨質(zhì)疏松，但曲線下面積（AUC）、靈敏性、特異性及準確性均不理想。聯(lián)合診斷模型診斷骨質(zhì)疏松的曲線下面積（A

13、UC）、靈敏性、特異性及準確性較單個循環(huán)microRNA確有顯著提升。Index1的診斷效能高于Index2及血清tPINP、β-CTx，并且Index1+P+C的診斷效能并不優(yōu)于Index1。
　　6.通過動物模型，明確了2月齡、8月齡、12月齡、16月齡小鼠的骨密度逐漸降低，血清miR-199a-5p的表達量逐漸降低。明確了假手術、卵巢切除后1天、卵巢切除后2周、卵巢切除后8周的大鼠骨密度逐漸降低，血清miR-199a-5p的

14、表達量逐漸降低。明確了BMMSCs系統(tǒng)注射后，卵巢切除大鼠的骨量丟失明顯減少，成骨平衡活性增強、破骨活性減弱，血清miR-199a-5p的表達量回升。
　　結論:
　　1.我們建立的生物樣本庫所納入的樣本能夠反映骨質(zhì)疏松流行病學基本特征，具有較好的臨床代表性。
　　2.骨量正常、骨量降低和骨質(zhì)疏松三類人群的血清microRNA表達譜存在差異，基于循環(huán)microRNA的分子生物學診斷方法可以有效診斷骨質(zhì)疏松，并且具有替代