1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文ψ芋螺毒素MⅦA的表達(dá)與純化姓名：陳小穎申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：詹金彪20040501浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文陳小顳整片段，插入經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶酶切后的原核表達(dá)載體pET32a()。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5ct。挑取轉(zhuǎn)化菌落，分別抽提質(zhì)粒，經(jīng)DNA酶切、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)小量誘導(dǎo)表達(dá)、質(zhì)粒測(cè)序三步鑒定重組質(zhì)粒的DNA序列。將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a()一CTX轉(zhuǎn)化感

2、受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Trx／CTX融合蛋白。超聲破菌后取上清液及沉淀分別經(jīng)SDSPAGE電泳檢查，表明融合蛋白幾乎都是可溶性的，存在于上清中，故取上清純化。利用融合蛋白中的6xHisTag，采用金屬螫合親和層析方法(Cu—IDA樹(shù)脂)純化融合蛋白，經(jīng)凝膠過(guò)濾除鹽，將各次處理的產(chǎn)物分別取樣用SDSPAGE驗(yàn)證含量及純度，最后合并純度較高的樣品用RP—HPLC(Reversephasehigh—performa

3、nceliquidchromatography)鑒定。由于融合蛋白中吉多個(gè)Cys殘基，而目的蛋白CTX的生物學(xué)活性決定于它所含的三對(duì)二硫鍵的正確配對(duì)，故先在純化產(chǎn)物中加入一定濃度的巰基乙醇(13一mercaptoethanol，BME)，還原所有可能形成的二硫鍵，然后在一定的鹽濃度下透析去除蛋白液中的BME，緩漫空氣氧化使之配對(duì)形成天然結(jié)構(gòu)的二硫鍵。經(jīng)還原氧化處理后的融合蛋白，采用經(jīng)典的小鼠熱板鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)鑒定其生物學(xué)活性?！窘Y(jié)果l目的基因

4、與載體基因連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5c‘后，挑取菌落分別抽提質(zhì)粒篩選鑒定。DNA酶切重組質(zhì)粒證實(shí)有小片段基因插入，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌，經(jīng)小量誘導(dǎo)表達(dá)出符合預(yù)計(jì)分子量的融合蛋白，DNA測(cè)序證實(shí)(J)CTXMVIIA基因序列按預(yù)計(jì)方案正確插入原核表達(dá)載體pET32a()。經(jīng)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)Trx／CTX融合蛋白，SDSPAGE可見(jiàn)其分子量(Mw)約197KD符合預(yù)計(jì)值，表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白