1、2009年3月,在墨西哥暴發(fā)的“人感染豬流感”疫情,并迅速在全球范圍內(nèi)蔓延。經(jīng)研究確定,此次疫情是由一個新型H1N1病毒亞型引起的,人群沒有天然免疫力,疫情幾經(jīng)在全球范圍傳播。據(jù)世衛(wèi)組織最新數(shù)據(jù),全球有214個國家和地區(qū)報告了甲型流感確診病例,出現(xiàn)至少18449個死亡病例。甲型H1N1流感對人及動物的健康造成巨大的影響,并且對社會造成了巨大的經(jīng)濟損失。鑒于甲型流感對畜牧業(yè)及人類公共衛(wèi)生安全造成的巨大威脅,進行對甲型流感抗原實施監(jiān)測以及時

2、了解甲型流感的流行狀況尤為重要,但目前市場上還沒有檢測甲型H1亞型豬流感病毒抗原(北美流感)的試劑盒,也無區(qū)分甲型H1亞型豬流感病毒(北美流感)和經(jīng)典H1亞型流感病毒的鑒別診斷試劑盒,因此建立一系列簡便快速、特異敏感、直觀有效的用于甲型流感病毒的檢測方法迫在眉睫。本課題研究過程中制備了多株抗甲型Hl亞型流感病毒血凝素的單克隆抗體,并以此抗體作為原材料,分別建立甲型H1亞型流感病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法和甲型H1亞型流感病毒免疫膠體

3、金檢測方法,其分別具備靈敏度高、特異性強、操作簡便以及可以批量測定等優(yōu)點和簡便快捷、特異性強的優(yōu)點。為進一步診斷和監(jiān)測甲型H1亞型流感抗原奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 1.甲型H1亞型流感病毒血凝素單克隆抗體的制備
　　 本研究通過接種、增殖甲型H1亞型流感病毒,將收獲的尿囊液用甲醛滅活。用純化后病毒免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合。采用血凝抑制實驗篩選,經(jīng)過有限稀釋法對其進行克隆,經(jīng)過2次融合共

4、獲得10株能穩(wěn)定分泌抗甲型H1亞型流感病毒血凝素單克隆抗體的雜交瘤細胞株,并得到特異性好、效價高的單克隆抗體。所得雜交瘤細胞株分別命名為1C9、2B3、2C5、2H7、3G12、4D7、4B12、4E1、5D5、5F7,腹水HI效價均在213～219,經(jīng)試驗測定,其中7株抗體只與甲型H1亞型流感病毒發(fā)生血凝抑制反應,而不與經(jīng)典H1亞型豬流感病毒及其它亞型流感病毒不發(fā)生交叉反應,具有良好的特異性,其余3株單克隆抗體不僅與甲型H1亞型流感病

5、毒發(fā)生血凝抑制反應,而且與部分經(jīng)典H1亞型豬流感病毒發(fā)生血凝抑制反應,對其它亞型流感病毒反應結(jié)果為陰性。
　　 2.甲型H1亞型流感病毒檢測方法的建立
　　 以抗甲型H1亞型流感病毒血凝素單克隆抗體基礎(chǔ),分別建立甲型H1亞型流感病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法和甲型H1亞型流感病毒免疫膠體金檢測方法,其分別具備靈敏度高、特異性強、操作簡便以及可以批量測定等優(yōu)點和簡便快捷、特異性強的優(yōu)點。這兩種方法對其它亞型的流感病毒進行

6、檢測,如:經(jīng)典H1亞型、H3亞型、H5亞型、H9亞型的流感病毒,結(jié)果顯示均為陰性；并且這兩種方法對畜禽類主要病毒進行檢測,如:將豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬乙腦病毒(JEV)、雞新城疫病毒(NDV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、雞減蛋綜合癥病毒(EDSV),結(jié)果顯示均為陰性,說明這兩種方法具有很好的特異性。以甲型H1亞型流感病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法為基礎(chǔ)組裝的甲型H1