1、本研究分為二部分：
　　第一部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Toll樣受體2信號(hào)通路對(duì)IL-6分泌的影響
　　目的：利用特異性的激動(dòng)劑、阻斷劑以及siRNA，探討MSC中TLR2、NFκB對(duì)IL-6分泌的影響，揭示MSC內(nèi)源性IL-6分泌的可能信號(hào)通路，并通過(guò)MSC與OGD損傷PC12細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型，初步探討MSC內(nèi)源性分泌IL-6的可能生物學(xué)功能。
　　方法：在本課題組前期研究工作基礎(chǔ)上，以EBSS無(wú)糖培養(yǎng)基替換PC12常

2、規(guī)培養(yǎng)基，在5％ O2、95％ N2和5％ CO2的三氣培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4h，建立OGD損傷PC12細(xì)胞模型，損傷后與MSC混合共培養(yǎng)24h，同時(shí)以單獨(dú)OGD損傷PC12為損傷對(duì)照組，以正常PC12細(xì)胞共培養(yǎng)為共培養(yǎng)對(duì)照組，western blotting方法檢測(cè)凋亡因子Bax的表達(dá)變化，ELISA試劑盒檢測(cè)不同處理組中IL-6的分泌水平變化。TLR2激動(dòng)劑PGN-SA8ug/ml處理MSC24h、腺病毒Ad-siTLR2干預(yù)MSC2

3、4h和48h，或NFκB阻斷劑PDTC處理MSC24h后，分別用real-time PCR和/或western blotting檢測(cè)不同干預(yù)條件下MSC中TLR2、NFκB和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：(1)經(jīng)western blotting檢測(cè)，OGD損傷的PC12細(xì)胞與MSC混合共培養(yǎng)組中凋亡因子Bax的表達(dá)水平顯著低于PC12 OGD損傷組及PC12細(xì)胞自身共培養(yǎng)組（P＜0.05，P＜0.01）。(2)EL

4、I SA方法檢測(cè)顯示OGD損傷的PC12細(xì)胞與MSC混合共培養(yǎng)組中IL-6的分泌水平顯著高于PC12 OGD損傷組及PC12細(xì)胞自身共培養(yǎng)組（P＜0.001）。(3)real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PGN-SA及Ad-siTLR2均可特異性激動(dòng)或抑制TLR2的mRNA表達(dá)水平（P＜0.01，P＜0.001），與未處理組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）;同時(shí)隨著TLR2 mRNA表達(dá)水平的變化，細(xì)胞中的

5、NFκB和IL-6 mRNA表達(dá)水平也會(huì)呈現(xiàn)相應(yīng)的增高或降低。(4) western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，PGN-SA可特異性上調(diào)MSC中TLR2的蛋白表達(dá)水平(P＜0.01)，并引起NFκB和IL-6的蛋白表達(dá)水平增高，經(jīng)灰度值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與未處理組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01); Ad-siTLR2特異性抑制MSC中TLR2的蛋白表達(dá)水平（P＜0.01），同時(shí)導(dǎo)致NFκB和IL-6的蛋白表達(dá)水平降低，經(jīng)灰度值統(tǒng)計(jì)學(xué)分

6、析，與RFP組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，P＜0.001）;NFκB的阻斷劑在特異性下調(diào)MSC中NFκB蛋白表達(dá)水平的同時(shí)(P＜0.01)，繼而導(dǎo)致IL-6的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），但對(duì)TLR2的表達(dá)無(wú)明顯影響（P＞0.05）。
　　結(jié)論：(1) MSC共培養(yǎng)可降低OGD損傷PC12細(xì)胞中凋亡基因Bax的表達(dá)水平，提示MSC對(duì)損傷的PC12細(xì)胞具有修復(fù)作用，這種修復(fù)作用可能與MSC內(nèi)源性IL-6的高分泌有關(guān)。

7、(2) PGN-SA或Ad-siTLR2可特異性改變TLR2的表達(dá)水平，同樣也可引起NFκB和IL-6表達(dá)水平的相應(yīng)變化。(3)PDTC可有效抑制MSC中NFκB和IL-6的表達(dá)水平，但對(duì)TLR2的表達(dá)無(wú)顯著作用，提示MSC分泌IL-6是通過(guò)TLR2/NFκB信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。
　　第二部分：白細(xì)胞介素-6對(duì)Toll樣受體2信號(hào)通路及其神經(jīng)修復(fù)的影響
　　目的：篩選siIL-6-MSC穩(wěn)定細(xì)胞株，并用腺病毒Ad-IL-6干預(yù)

8、MSC探討MSC內(nèi)源性IL-6分泌對(duì)TLR2/NFκB信號(hào)通路的調(diào)控，闡明MSC分泌IL-6的分子機(jī)制，并揭示MSC對(duì)損傷PC12細(xì)胞可能的修復(fù)功能。
　　方法：腺病毒Ad-IL-6瞬時(shí)干預(yù)MSC24h或48h后，利用real-timePCR或western blotting檢測(cè)干預(yù)后MSC中TLR2、NFκB和IL-6的mRNA及蛋白表達(dá)水平變化。采用siIL-6慢病毒感染MSC，通過(guò)5ug/ml的puromycin進(jìn)行加壓篩選

9、，獲得siIL-6穩(wěn)定表達(dá)的MSC細(xì)胞株并鑒定。將所獲得的siIL-6-MSC細(xì)胞與OGD損傷PC12細(xì)胞共培養(yǎng)24h，同時(shí)以GFP-MSC為共培養(yǎng)對(duì)照組，western blotting檢測(cè)凋亡基因Bax的表達(dá)變化，全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)共培養(yǎng)組中PC12細(xì)胞的靜息膜電位變化情況。
　　結(jié)果：(1)腺病毒Ad-IL-6感染MSC后可明顯上調(diào)IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平（P＜0.01，P＜0.001），但并不影響TLR2和NFκB的

10、表達(dá)。(2)經(jīng)puromycin篩選后獲得的siIL-6-MSC穩(wěn)定細(xì)胞株，在倒置熒光顯微鏡下可見較強(qiáng)綠色熒光，感染率約85％以上，進(jìn)一步檢測(cè)siIL-6-MSC穩(wěn)定細(xì)胞株中IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平均有顯著性的降低(P＜0.05，P＜0.001)，但該細(xì)胞中的TLR2和NFκB的表達(dá)水平并沒有顯著性的變化。(3) OGD損傷PC12細(xì)胞與siIL-6-MSC共培養(yǎng)后，其凋亡因子Bax的表達(dá)水平明顯高于GFP-MSC對(duì)照組（P＜0

11、.01）;全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)與siIL-6-MSC共培養(yǎng)后的OGD損傷PC12細(xì)胞膜靜息電位與閡電位差值明顯高于對(duì)照組。表明IL-6表達(dá)水平降低時(shí)，MSC對(duì)OGD損傷PC12細(xì)胞的促修復(fù)作用下降。
　　結(jié)論：(1)成功篩選出siIL-6穩(wěn)定表達(dá)的MSC細(xì)胞株。(2) IL-6表達(dá)水平的增高或降低并不影響MSC中TLR2和NFκB的表達(dá)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證MSC內(nèi)源性IL-6的分泌是通過(guò)TLR2/NFκB信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的，且IL-6的分泌