1、近年來，在腫瘤領(lǐng)域研究的重大進(jìn)展之一是確立了腫瘤血管生成在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用及意義。相關(guān)抗腫瘤血管生成藥物也孕育而生，如貝伐單抗、舒尼替尼、索拉非尼等。然而，在臨床運(yùn)用中因所取得的療效有限，出現(xiàn)耐藥，甚至無效，患者所獲得的生存期有限，并最終出現(xiàn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，科學(xué)家也逐步認(rèn)識(shí)到腫瘤缺氧微環(huán)境對(duì)腫瘤血管生成的影響，并影響抗腫瘤血管生成藥物的作用。
　　 現(xiàn)代腫瘤研究中，中醫(yī)藥，亦為腫瘤防治的一種重要策略。研究發(fā)現(xiàn)，活血化

2、瘀中藥對(duì)腫瘤血管生成有重要作用。本課題組在前期，已有相關(guān)研究證實(shí)水蛭具有抗腫瘤血管生成的作用。故本課題欲進(jìn)一步從腫瘤缺氧微環(huán)境探索水蛭在抗腫瘤血管生成中可能的作用機(jī)制，以期為水蛭抗腫瘤研究開辟新的探索途徑，為臨床運(yùn)用提供一定的理論依據(jù)。
　　 目的：探討水蛭能否通過改善腫瘤細(xì)胞缺氧微環(huán)境來抑制腫瘤血管生成及其相關(guān)機(jī)制研究。
　　 方法：采用氯化鈷模擬化學(xué)缺氧。在缺氧條件下，采用MTT法觀察水蛭含藥血清對(duì)EA.Hy926細(xì)

3、胞的增殖抑制作用;采用RT-PCR法檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）mRNA、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) mRNA的表達(dá);WesternBlotting法檢測(cè)HIF-1α蛋白水平;Matrivgel基質(zhì)膠模擬體外小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小管生成情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、缺氧條件下，水蛭含藥血清對(duì)EA.hy926細(xì)胞增殖作用的影響首先設(shè)定水蛭含藥血清濃度梯度0、5％、15％、25％、35％、45％，觀察水蛭含藥血清對(duì)

4、EA.hy926細(xì)胞增殖作用的影響，發(fā)現(xiàn)水蛭含藥濃度超過35％時(shí)細(xì)胞明顯死亡，可能是藥物本身的理化毒性對(duì)細(xì)胞有影響;水蛭含藥濃度在25％時(shí)的抑制作用尚無15％濃度的作用顯著，可能是由于含藥血清中血清的含量亦較高，其抑制作用和促進(jìn)作用相抵所致;在5％和15％濃度組，其抑制作用隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，因此以5％和15％濃度組分別作為低、高劑量組。從作用時(shí)間上看，在不同水蛭含藥血清濃度下，對(duì)EA.hy926細(xì)胞增殖的抑制率呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。雖然3

5、6h和48h同樣有明顯的抑制作用，但對(duì)于48h的顯著抑制作用考慮可能也存在細(xì)胞本身凋亡增加，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇藥物作用后36h的時(shí)間點(diǎn)觀察。
　　 2、缺氧條件下，水蛭含藥血清對(duì)EA.hy926細(xì)胞HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達(dá)的影響缺氧條件下，EA.hy926細(xì)胞在水蛭高、低劑量組作用后HIF-1αmRNA和VEGFmRNA的表達(dá)明顯降低，分別為0.33±0.10、0.50±0.12，0.76±0.14、0.92±0

6、.05，與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異（F=47.55、19.22，P=0.00、0.001）。水蛭高劑量組在HIF-1αmRNA的表達(dá)上與陽(yáng)性對(duì)照組的表達(dá)水平相當(dāng)，差異無顯著性（t=0.36，P=0.74），同時(shí)，高劑量組在VEGFmRNA的表達(dá)上較陽(yáng)性對(duì)照組表達(dá)的水平更低，兩組間差異有顯著性（t=2.95，P=0.04）。這說明缺氧時(shí)水蛭能抑制HIF-1αmRNA的表達(dá)并且能顯著抑制由HIF-1α所介導(dǎo)的靶基因VEGFmRNA的表達(dá)。

7、
　　 3、缺氧條件下，水蛭含藥血清對(duì)EA.hy926細(xì)胞HIF-1α蛋白水平的影響在缺氧條件下，各實(shí)驗(yàn)組EA.hy926細(xì)胞HIF-1α蛋白條帶，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，各組灰度值分別為2.84±0.71、5.12±0.04、5.34±0.28、3.67±0.36。與陰性對(duì)照組相比，高、低劑量水蛭組HIF-1α蛋白條帶灰度明顯變淺，差異有極顯著性（F=23.85，P=0.00）;水蛭高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組條帶灰度相當(dāng)，差異無

8、顯著性（t=1.33，P=0.25），但比水蛭低劑量組的條帶灰度淺，差異有顯著性（t=6.37，P=0.003）。這表明水蛭能抑制缺氧條件下HIF-1α蛋白的合成，且高劑量組的抑制作用更為明顯。
　　 4、缺氧條件下，水蛭含藥血清對(duì)EA.hy926細(xì)胞小管形成的影響內(nèi)皮細(xì)胞具有在體外分化形成血管樣結(jié)構(gòu)的能力。故將EA.hy926細(xì)胞鋪于Matrivgel基質(zhì)膠上進(jìn)行培養(yǎng)，模擬血管形成。在缺氧時(shí)，給予水蛭含藥血清作用36h后，EA

9、.hy926細(xì)胞連接形成小管狀結(jié)構(gòu)，且計(jì)數(shù)每個(gè)視野下的小管數(shù)，高、低劑量組分別為4.4±0.4、4.6±0.6，與陰性對(duì)照組（7.0±1.0）相比，小管數(shù)明顯減少，差異有顯著性（F=8.94，P=0.006），與陽(yáng)性對(duì)照組(5.2±0.6)相比，差異無顯著性（F=1.77，P=0.25）。說明水蛭具有在缺氧條件下抑制小管形成的作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、缺氧條件下，水蛭能明顯EA.hy926抑制細(xì)胞增殖，且呈時(shí)間和劑

10、量依耐性。
　　 2、缺氧條件下，水蛭能抑制HIF-1αmRNA的表達(dá)并且能顯著抑制由HIF-1α所介導(dǎo)的靶基因VEGFmRNA的表達(dá)。
　　 3、缺氧條件下，水蛭能抑制HIF-1α蛋白的合成，且高劑量組的抑制作用更為明顯。
　　 4、缺氧條件下，在體外小管形成實(shí)驗(yàn)中，水蛭使EA.hy926細(xì)胞小管形成數(shù)目減少，以高劑量組作用明顯。
　　 說明蟲類中藥水蛭能通過改善腫瘤缺氧微環(huán)境抑制腫瘤血管生成來發(fā)揮抗腫