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1、目的:中藥化學(xué)成分和體內(nèi)吸收代謝成分是中藥發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的不斷進(jìn)步,對(duì)中藥化學(xué)成分和體內(nèi)吸收代謝成分進(jìn)行定性與定量分析已成分中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重要手段之一。本論文以兩味常見中藥何首烏和附子為研究對(duì)象,采用超高壓液相與線性離子阱軌道離子阱組合高分辨質(zhì)譜(UHPLC-LTQ-Orbitrap)聯(lián)用技術(shù)系統(tǒng)分析附子和何首烏中的天然活性(毒性)成分。深入研究何首烏代表性成分二苯乙烯苷、葸醌類等,附子代表性
2、成分二萜類生物堿成分的高分辨多級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律。在此基礎(chǔ)上開展何首烏藥材定量方法研究、大鼠體內(nèi)代謝輪廓研究和大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究,為中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和中藥現(xiàn)代化研究探索新的可行的方法和技術(shù)。
方法:⑴運(yùn)用LTQ-Orbitrap高分辨多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)研究何首烏主要成分二苯乙烯苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律。方法為以何首烏代表性成分二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、
3、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素等作為模式成分,采用直接持續(xù)進(jìn)樣方式,進(jìn)樣速度為8μL/min。質(zhì)譜全掃描范圍為m/z150-1500,高分辨全掃描分辨率設(shè)為30000(以m/z400的半峰寬計(jì)),MS2-MS3采用Orbitrap高分辨掃描,掃描分辨率設(shè)為15000,MS4以后的子離子采用用LTQ打拿極(dynote)檢測(cè)。選擇上一級(jí)最高峰進(jìn)行下級(jí)碎裂掃描,碎裂方式為碰撞誘導(dǎo)解離(CID)方式,其碰撞能量為35%。⑵建立基于何首烏及相關(guān)藥材
4、的化學(xué)成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,并運(yùn)用UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn技術(shù),結(jié)合模式成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律,對(duì)何首烏藥材化學(xué)成分進(jìn)行分析。液相條件為:色譜柱采用Thermo Hypersil Gold C18 column(2.1×100 mm,1.8μm),流動(dòng)相由乙腈(A)和含0.1%甲酸水(B)兩相組成,其洗脫梯度為:5%A(0min);15%A(6min),15%A(12min);38%A(25min);70%A(30min)和9
5、0%A(35 min)。流速為300μL/min。在線DAD檢測(cè)200-400 nm范圍光譜。質(zhì)譜條件為:通過電噴霧離子源(ESI)與液相部分連接,分別采用正、負(fù)離子檢測(cè)模式各采集一次,掃描范圍為m/z150-1500,離子源所用氣體為氮?dú)狻R患?jí)全掃描采用高分辨設(shè)置,其分辨率設(shè)置為30000,二級(jí)質(zhì)譜高分辨全掃描分辨率設(shè)為15000,三級(jí)質(zhì)譜高分辨全掃描設(shè)置為7500。多級(jí)掃描采用數(shù)據(jù)依賴性掃描(data-dependent MSn s
6、canning),選取上一級(jí)最高豐度母離子進(jìn)行碎裂并進(jìn)行動(dòng)態(tài)排除設(shè)置(dynamics exclusion)。⑶運(yùn)用液相與離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立快速測(cè)定何首烏4種代表性成分大黃素、大黃素-8-O-葡萄糖苷、沒食子酸和二苯乙烯苷含量的方法,并對(duì)20批不同產(chǎn)地、不同炮制來源的中藥何首烏飲片進(jìn)行檢測(cè)。采用Thermo fisher Accela UHPLC超高壓色譜系統(tǒng)。色譜柱為Waters UPLC BEH C18柱(2.1 mn×50 m
7、m,1.7μm)。流動(dòng)相為乙腈(A)和0.1%甲酸水系統(tǒng)組成,梯度洗脫。系統(tǒng)程序?yàn)?13%A(0 min),35%A(3.5 min),90%A(7.5 min),95%A(8.5 min)和95%A(10 min),每次進(jìn)樣前以初速流動(dòng)相平衡4 min。流速為400μL/min。柱溫為室溫。進(jìn)樣量為5μL。在線DAD檢測(cè)記錄200-400nm光譜數(shù)據(jù)。質(zhì)譜方法采用LTQ-Orbitrap高分辨多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用儀并通過ESI接口與液相部分相
8、連。定性檢測(cè)采用子離子全掃描模式,通過對(duì)比保留時(shí)間、碎片離子豐度、碎片離子高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)用于定性檢測(cè)。定量采用SRM的方法,即選擇目標(biāo)成分的母離子在離子阱內(nèi)進(jìn)行二級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè),選擇最高響應(yīng)子離子進(jìn)行監(jiān)測(cè)。其離子對(duì)選擇如下:gallic acid: m/z169→125; emodin: m/z269→225; THSG: m/z405→243;Emodin-8-glu: m/z431→269。⑷應(yīng)用UHPLC-LTQ-Orbitrap技術(shù)
9、系統(tǒng)研究何首烏在大鼠血液和尿液的代謝輪廓,利用相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)、診斷離子搜尋策略及高分辨多級(jí)質(zhì)譜信息從大鼠血液和尿液樣品中推測(cè)體內(nèi)成分。方法為:SD大鼠分尿液組、血液組和空白組。大鼠代謝籠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,間隔1.5 h灌胃2次首烏提取液,每次劑量為2 mL/kg,空白組給予相應(yīng)劑量生理鹽水。其中尿液組大鼠按第一次給藥時(shí)間計(jì)收集0.5 h-3 h尿液。血液組第二次給藥后間隔0.5 h眼眶靜脈采血,采血前10%水合氯醛麻醉,采血3次,分別為第二
10、次給藥后30 min、1h、1.5 h。同時(shí)收集空白組尿液和血樣。所得血樣經(jīng)低速離心(5000rpm,10 min),取上層血漿,-80℃保存。血漿樣品經(jīng)有機(jī)溶劑沉淀法處理,尿液樣品經(jīng)甲醇蛋白沉淀,取上清液,濃縮至2mL,加入2 mL乙腈-甲醇混合試劑(3∶1),漩渦5 min,高速離心(15000 rpm,10 min)。取上清液,即得。液相部分采用Thermo-Fisher Accela UHPLC色譜系統(tǒng)。色譜柱為Phemomen
11、exKinetex C18(2.1×100 mm,2.6μm)。流動(dòng)相為乙腈(A)和0.1%甲酸水系統(tǒng)組成,梯度洗脫。系統(tǒng)程序?yàn)?5%A(0 min),35%A(13.5 min),60%A(23.5min),90%A(30min),每次進(jìn)樣前以初速流動(dòng)相平衡4 min。流速為200μL/min。柱溫為室溫。進(jìn)樣量為5μL。在線DAD檢測(cè)記錄200-400nm光譜數(shù)據(jù)。質(zhì)譜部分采用LTQ-Orbitrap高分辨多級(jí)質(zhì)譜儀并通過ESI接口
12、與液相部分相連,同前法采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。⑸采用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS對(duì)大鼠灌胃何首烏二苯乙烯苷和大黃素血藥濃度和藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了初步研究。SD大鼠SPF級(jí)動(dòng)物房室溫環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。按1 mL/100g劑量分別灌胃給予生首烏,另取空白組給予相應(yīng)劑量生理鹽水用于采集空白血漿。并于給藥后5、10、15、20、30、45、60、120、240、480 min大鼠眼眶靜脈叢取血750μL至1.5 mL EP管內(nèi)。所得
13、血樣于3h內(nèi)經(jīng)4℃低速離心(5000rpm,10 min),取上層血漿,-80℃保存。色譜柱采用Waters UPLC BEH C18(2.1×100 mm,1.7μm)。流動(dòng)相為乙腈(A)和0.1%甲酸水系統(tǒng)組成,梯度洗脫。系統(tǒng)程序?yàn)?8%A(0 min)、30%A(3.5 min)、85%A(7.5 min)、90%A(8.5 min)、90%A(10 min)。流速為400μL/min。柱溫為室溫。進(jìn)樣量為5μL。質(zhì)譜定性檢測(cè)采用
14、子離子高分辨全掃描模式,即選擇待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品二苯乙烯苷、大黃素和內(nèi)標(biāo)物虎杖苷、白藜蘆醇的精確母離子m/z405、269、389、227進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜高分辨全掃描,通過對(duì)比保留時(shí)間、碎片離子豐度、碎片離子高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)用于定性檢測(cè)。定量檢測(cè)采用Orbitrap高分辨選擇離子監(jiān)測(cè)模式(HR-SIM)。⑹系統(tǒng)研究了附子代表性生物堿成分在UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn碎裂行為。方法為:采用直接持續(xù)進(jìn)樣方式,進(jìn)樣速度為3μL/min。質(zhì)譜
15、全掃描范圍為m/z150-1500,高分辨全掃描分辨率設(shè)為30000(以m/z400的半峰寬計(jì)),MS2-MS3采用Orbitrap高分辨掃描,掃描分辨率設(shè)為15000,MS4以后的子離子采用LTQ打拿極(dynote)檢測(cè)。選擇上一級(jí)最高峰進(jìn)行下級(jí)碎裂掃描,碎裂方式為碰撞誘導(dǎo)解離(CID)方式,其碰撞能量為40%,選擇峰寬范圍為m/z±1,其他參數(shù)為默認(rèn)。以特征離子信號(hào)和多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),輔以高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)證實(shí),推測(cè)代表性
16、附子生物堿在正離子模式下可能的裂解規(guī)律。⑺使用UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn技術(shù)對(duì)中藥附子化學(xué)成分進(jìn)行了定性分析,利用模式成分的裂解規(guī)律,自建的二萜類生物堿質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫并結(jié)合文獻(xiàn),建立了系統(tǒng)鑒定流程和策略,用于附子生物堿未知成分的檢測(cè)。
結(jié)果:①運(yùn)用LTQ-Orbitrap高分辨多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)系統(tǒng)研究了何首烏主要成分二苯乙烯苷的質(zhì)譜裂解規(guī)律。對(duì)其關(guān)鍵的離子碎裂位置進(jìn)行了分析與模擬,高分辨質(zhì)譜證實(shí)m/z225、215、
17、137子離子均源于A環(huán)的內(nèi)部碎裂形成的碎片,而m/z149源于鏈接A、B環(huán)的烯鍵重排碎裂形成。這些關(guān)鍵的裂解途徑為從何首烏中尋找相似成分提供依據(jù)。運(yùn)用LTQ-Orbitrap高分辨多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)比較了幾種不同取代葸醌類成分的特征碎裂模式,對(duì)形成的多個(gè)奇電子離子進(jìn)行了歸屬。首次全面分析了兒茶素和表兒茶素在LTQ-Orbitrap質(zhì)譜中的裂解行為,為研究何首烏相關(guān)鞣質(zhì)及兒茶素衍生物的定性檢測(cè)提供依據(jù)。②建立了基于何首烏及相關(guān)藥材的化學(xué)成分質(zhì)譜
18、數(shù)據(jù)庫,并運(yùn)用UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn技術(shù),結(jié)合模式成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律,對(duì)何首烏藥材化學(xué)成分進(jìn)行分析,共鑒定或推測(cè)87個(gè)成分,包括15個(gè)二苯乙烯類成分、19個(gè)蒽醌類成分、13個(gè)鞣質(zhì)或沒食子酸衍生物、6個(gè)萘類成分等。首次從何首烏中發(fā)現(xiàn)28個(gè)新的蒽醌二聚體糖苷成分(二葸酮苷),運(yùn)用高分辨質(zhì)譜技術(shù)證實(shí)了何首烏中二葸酮糖苷成分為emodin(10→10') emodin或emodin(10→10') physcion的母核。
19、研究發(fā)現(xiàn)該類成分在ESI軟電離及CID碎裂下通過10-10'均裂形成特征性的奇電子離子,這是首次從何首烏中發(fā)現(xiàn)有大量二葸酮成分的存在。③縱觀國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn),創(chuàng)新性地運(yùn)用液相與離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速測(cè)定何首烏4種代表性成分大黃素、大黃素-8-O-葡萄糖苷、沒食子酸和二苯乙烯苷含量的方法,并運(yùn)用于20批不同產(chǎn)地、不同炮制來源的中藥何首烏飲片的檢測(cè),結(jié)果表明線性離子阱質(zhì)譜用于定量方法開發(fā)具有快速靈敏的優(yōu)點(diǎn),可用于何首烏及其相關(guān)制品的質(zhì)量控制;研究
20、結(jié)果表明不同產(chǎn)地首烏指標(biāo)性成分含量差異巨大,炮制后何首烏的多個(gè)指標(biāo)成分含量明顯降低。④應(yīng)用UHPLC-LTQ-Orbitrap技術(shù)系統(tǒng)研究何首烏在大鼠血液和尿液的代謝輪廓,利用相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)、診斷離子搜尋策略及高分辨多級(jí)質(zhì)譜信息從大鼠血液和尿液樣品中推測(cè)了45個(gè)體內(nèi)成分。包括5個(gè)原形成分和40個(gè)代謝成分。結(jié)果表明大鼠灌胃何首烏代謝成分以大黃素、二苯乙烯苷、大黃素甲醚的葡萄糖醛酸和硫酸酯化的二相代謝產(chǎn)物為主,此外還檢測(cè)到大黃素氧化與甲基化、
21、二苯乙烯苷糖苷鍵水解和烯鍵的還原的一相代謝產(chǎn)物。⑤采用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS對(duì)大鼠灌胃何首烏二苯乙烯苷和大黃素血藥濃度和藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了初步研究。創(chuàng)新性地采用超高分辨SIM模式建立了二苯乙烯苷和大黃素的體內(nèi)定量檢測(cè)方法,結(jié)果表明Orbitrap高分辨SIM模式具有去干擾能力強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高、快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn),通過LTQ-Orbitrap定性結(jié)合定量研究中藥復(fù)雜體系的藥代動(dòng)力學(xué)和系統(tǒng)描繪中藥體內(nèi)代謝輪廓具有一定的優(yōu)勢(shì)。⑥
22、系統(tǒng)研究了附子代表性生物堿成分在UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn碎裂行為。以特征離子信號(hào)和多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),輔以高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)證實(shí),推測(cè)代表性附子生物堿在正離子模式下可能的裂解規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn),在二萜類生物堿C1、C3和C16等取代基位置為L(zhǎng)TQ-Orbitrap質(zhì)譜優(yōu)先裂解的位點(diǎn),在多級(jí)質(zhì)譜中脫水與C3-OH有關(guān),而特征性的CO中性丟失與C16位羥基重排有關(guān),附子原堿成分的二級(jí)質(zhì)譜形成的基峰可用來區(qū)分它們的C1、
23、C3位取代模式。這些不同類型附子生物堿的特征質(zhì)譜裂解規(guī)律和特征碎片離子有利于對(duì)附子未知生物堿的鑒定和結(jié)構(gòu)分析。⑦使用UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn技術(shù)對(duì)中藥附子化學(xué)成分進(jìn)行了定性分析,利用模式成分的裂解規(guī)律,自建的二萜類生物堿質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫并結(jié)合文獻(xiàn),建立了系統(tǒng)鑒定流程和策略,檢出120余個(gè)附子生物堿成分,包括首次報(bào)道的DDA、MDA、LDA和ADA類成分,基本闡明了中藥附子的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ),為今后的化學(xué)成分研究、指紋圖譜及質(zhì)量
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