1、目的:
　　 所謂自噬是指細胞利用溶酶體降解自身成分的過程，被降解成分包括細胞質和細胞器。細胞自噬是一種分解代謝過程，它可以使細胞循環(huán)再利用細胞漿內的成分，因此從節(jié)省生物能的角度看，細胞自噬是細胞內各種成分重新合成的有效替代途徑。根據細胞物質運送到溶酶體途徑的不同，自噬可以分為:巨自噬，微自噬，分子伴侶介導的自噬。眾多研究顯示細胞主要通過自噬途徑消化長壽命的蛋白和細胞器，在細胞應激情況下，如饑餓、去除細胞因子等，自噬多數起保護細

2、胞的作用;但在某些特定的情況下，當細胞自噬過度發(fā)生時又可導致細胞死亡。所以，自噬對于細胞的存活和死亡起到雙刃劍的作用。
　　 BAG3是Bcl-2相關抗凋亡家族蛋白的重要成員，BAG3蛋白含有WW結構域，與Bcl-2和Hsp70相互作用的BAG結構域，以及一個具有多個PXXP基序的脯氨酸富含區(qū)域，該蛋白主要分布于細胞漿。除骨骼及心肌組織BAG3具有較高表達水平之外，在其它正常組織中BAG3的表達很弱或者不表達;而在一些腫瘤細胞如

3、白血病、實體性腫瘤細胞內BAG3表達水平較高，維持腫瘤細胞的存活。研究證實，重金屬（鋅、鎘）、高溫、蛋白酶體抑制劑等應激在轉錄水平誘導BAG3表達，現(xiàn)證實HSF1、Egrl等轉錄因子調控BAG3的表達。最近BAG3在自噬中的作用受到極大關注，研究發(fā)現(xiàn)BAG3可以和HSPB8、HSP70形成復合物，直接促進錯誤折疊蛋白（如亨廷頓polyQ、變異SOD1）向聚集體的運輸，進而調控錯誤折疊蛋白和蛋白聚集體的選擇性自噬。
　　 本實驗在

4、已有的研究基礎上，利用血清饑餓對細胞產生饑餓影響，觀察細胞內BAG3水平的改變，及對細胞生存能力的影響，為進一步理解BAG3在調控細胞生存能力中的作用及分子機制奠定基礎。
　　 方法:
　　 1、培養(yǎng)HEK293、MCF7、FRO、LK87、SKVO3、HepG2細胞;BAG3穩(wěn)定過表達的HEK293、MCF7、U87細胞;EGFP-LC3B穩(wěn)定過表達的HEK293細胞;利用脂質體介導轉染技術瞬時轉染pcDNA3.1、c

5、-Jun、c-Jun(DBD)表達載體或對照。
　　 2、應用Real-Time PCR法檢測對照組與實驗組中BAG3、JunD的mRNA表達變化。
　　 3、應用Western Blot法檢測對照組與實驗組中BAG3、JunD、c-Jun的蛋白表達差異。
　　 4、應用Click-iT(R) Nascent RNA Capture試劑盒標記并分離新生mRNA。
　　 5、應用染色質免疫沉淀法分析c-Ju

6、n與BAG3啟動子的相互作用關系。
　　 6、應用MTT比色分析法、Hoechst染色、Trypan blue分別檢測BAG3對細胞生存能力、凋亡、死亡的影響;應用廣譜凋亡抑制劑z-VAD觀察凋亡在增殖抑制中的作用。
　　 7、應用PI染色、流式細胞技術檢測細胞周期變化。
　　 8、自噬的檢測:應用AO熒光染料染色，觀察細胞內酸性泡數量及結構的變化;熒光顯微鏡觀察EGFP-LC3B的分布;Western blot

7、檢測LC3由Ⅰ型向Ⅱ型的轉變。
　　 9、自噬抑制劑3-MA檢測自噬在增殖抑制中的作用。
　　 結果:
　　 1、血清饑餓在多種細胞中下調了BAG3的表達。
　　 2、血清饑餓在轉錄水平通過c-Jun降低BAG3表達。
　　 3、BAG3增加血清饑餓抑制細胞增殖的能力。
　　 4、BAG3抑制血清饑餓誘導的細胞自噬水平增加程度。
　　 5、BAG3增加血清饑餓抑制細胞增殖的能力與自