1、目的：探討二氮嗪(DZ)對骨髓源性心肌干細胞(MCSCs)抗氧化應激的作用及其機制,明確自聚肽納米纖維對MCSCs增殖、存活及向心肌細胞分化的作用,為將新型納米材料自聚肽應用于臨床干細胞移植治療心肌梗死等缺血性心臟病提供理論和實驗依據(jù)。方法通過單細胞克隆培養(yǎng)技術、c-kit免疫熒光標記和RT-PCR檢測心肌早期轉錄因子Nkx2.5的表達,從骨髓間充質干細胞中篩選具有心肌特異分化潛能的MCSCs。利用H2O2處理MCSCs造成氧化應激損傷

2、,AnncxinV/PI雙標記和乳酸脫氫酶(LDH)泄漏實驗檢測細胞凋亡和膜完整性以及DZ的保護作用。采用免疫染色法進行細胞色素C的定位,RT-PCR.和Western blot檢測DZ對細胞HGF、bFGF及VEGF的基因表達和Akt磷酸化水平變化,探討DZ對細胞保護作用的機制。固相合成新型納米材料自聚肽,掃描電鏡和原子力顯微鏡下觀察自組裝后的形態(tài)結構。將細胞懸液與等體積1％自聚肽溶液混合后培養(yǎng)1d時,在掃描電鏡和透射電鏡下觀察自聚肽

3、納米纖維與細胞的相互關系。通過CCK-8法和AO/EB染色法檢測自聚肽納米纖維對MCSCs增殖和存活的作用。將MCSCs在自聚肽納米纖維中培養(yǎng)4wk,用相差顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞形態(tài)變化,采用免疫熒光染色檢測cTnT的表達,綜合評價自聚肽納米纖維對MCSCs向心肌細胞分化的作用。建立大鼠急性心肌梗死模型,30min后,將實驗隨機分為5組,即對照組、MCSCs移植組、DZ預處理MCSCs移植組、自聚肽承載MCSCs移植組、自聚肽承載DZ

4、預處理MCSCs移植組。細胞移植后4wk,用M型超聲心動圖檢測心功能恢復狀態(tài)。取各組心臟作組織切片,進行Masson染色和免疫組織化學染色,利用圖像分析檢測瘢痕面積、膠原纖維比率和微血管密度。用原位熒光雜交法標記心肌組織中Y染色體陽性移植細胞,并檢測其cTnT的表達。結果經DZ預處理后,在氧化應激條件下細胞凋亡率下降,LDH的泄漏減少,與未預處理組比較,差異具有統(tǒng)計學意義。氧化應激損傷引起線粒體內的細胞色素C滲漏到細胞質,經DZ預處理后

5、,未觀察到明顯的細胞色素C滲漏現(xiàn)象。DZ預處理后細胞內HGF和bFGFmRNA表達顯著上調,同時磷酸化Akt表達上調。本實驗合成的自聚肽純度為97.52％。掃描電鏡下可見,1％RAD16-Ⅱ多肽溶液在37℃條件下自組裝成納米纖維,并相互交織成網狀支架結構,該支架孔徑為50～200nm。原子力顯微鏡顯示,納米纖維直徑約10nm,長度為100～300nm。體外實驗研究顯示,用自聚肽承載MCSCs培養(yǎng)1d后,掃描電鏡下可見自聚肽自組裝成納米纖

6、維,在細胞之間形成網狀納米纖維支架。細胞呈長梭形,位于三維納米纖維支架的網孔中,生長狀態(tài)良好。在透射電鏡觀察到,細胞與細胞之間有許多均勻分布的納米纖維片段,纖維與細胞緊密相接。用CCK-8檢測法繪制細胞生長曲線,細胞在自聚肽納米纖維支架中的增殖能力明顯高于對照組,差異有顯著性意義。在體外缺血缺氧條件下培養(yǎng)8h后,自聚肽納米纖維支架中的細胞凋亡率明顯低于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義。MCSCs在自聚肽納米纖維中培養(yǎng)4wk時,在相差顯微鏡下可

7、見自聚肽納米纖維組與對照組細胞相比,形態(tài)和排列方式均發(fā)生明顯改變。掃描電鏡顯示,呈平行排列柱狀細胞之間可見少量纖維碎片,大部分納米纖維已降解。免疫熒光細胞化學染色顯示,自聚肽納米纖維組細胞的cTnT表達明顯強于對照組。心肌梗死模型大鼠在細胞移植4wk檢測結果顯示,DZ預處理MCSCs移植組的大鼠心功能恢復、心肌瘢痕面積減小和Y染色體陽性細胞數(shù)都優(yōu)于MCSCs移植組,差異有顯著性意義。與預處理MCSCs移植組相比,自聚肽承載細胞移植組大鼠

8、的心功能指數(shù)明顯提高、瘢痕面積明顯減小、微血管密度明顯增加、Y染色體陽性細胞數(shù)明顯增多,差異均具有顯著性意義。自聚肽承載MCSCs移植組和自聚肽承載預處理MCSCs移植組大鼠的心功能指數(shù)、瘢痕面積、微血管密度和Y染色體陽性細胞數(shù)差異沒有統(tǒng)計學意義。自聚肽承載細胞移植組心肌內的Y染色體陽性細胞主要分布于瘢痕區(qū)邊緣。免疫組織化學染色顯示,Y染色體陽性細胞表達cTnT,與周圍心肌細胞的cTnT表達強度相同。結論DZ預處理可以提高MCSCs的抗

9、氧化應激能力,其機制與減少細胞色素C從線粒體滲漏到細胞質以及提高細胞的HGF和bFGF基因表達有關。自聚肽納米纖維有利于MCSCs的增殖、存活和向心肌細胞分化,可以作為一種可注射的心肌組織工程材料。自聚肽承載MCSCs移植治療心肌梗死,有利于移植細胞在受損心肌內的存活和向功能性心肌分化,并促進血管新生,其療效優(yōu)于DZ預處理干細胞移植。這為將新型納米材料自聚肽應用于臨床干細胞移植治療心肌梗死等缺血性心臟病提供可行性的理論和實驗依據(jù)具有重要