1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文NFκB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和IL6在SMMC7721細(xì)胞對(duì)TNFα的細(xì)胞毒性效應(yīng)耐受中的作用實(shí)驗(yàn)研究姓名：楊季云申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：曾祥元2002.5.12用ELISA檢測(cè)TNFⅡ?qū)F—KB的活化作用；免疫組化檢測(cè)p65亞基的轉(zhuǎn)核。同時(shí)觀察NFKB信號(hào)通路活化對(duì)SMMC7721細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響及加入活化阻斷劑TPCK后，對(duì)IL一6mRNA表達(dá)、IL6分泌、凋亡和細(xì)胞周期的影響。結(jié)果

2、：1未刺激的SMMC7721細(xì)胞可以少量表達(dá)IL。6，加入TNFa后能明顯地誘導(dǎo)IL6的表達(dá)增加；隨刺激時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)呈持續(xù)性增加，8小時(shí)達(dá)到高峰，12小時(shí)至24小時(shí)稍有降低，此后IL6表達(dá)一直維持在較高水平。SMMC772l細(xì)胞表達(dá)IL一6的量隨TNFa濃度的增加而增加。正常培養(yǎng)狀態(tài)下SMMC一7721細(xì)胞IL一6mRNA表達(dá)微弱；TNFa刺激后能明顯地誘導(dǎo)IL一6mRNA的表達(dá)，至6小時(shí)達(dá)到高峰，8小時(shí)IL6mRNA表達(dá)略有下降，然

3、后一直維持較高的水平。2外源加入的IL6對(duì)SMMC7721細(xì)胞生長(zhǎng)起促進(jìn)作用。加入抗IL6、抗IL6R抗體時(shí)，SMMC一7721細(xì)胞存活率明顯降低。SMMC772l細(xì)胞對(duì)TNFn的敏感性也顯著增加。IL6、抗IL6、抗IL一6R對(duì)TNFa誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡沒(méi)有顯著影響。3ELISA檢測(cè)表明：10ng／mlTNF—Q刺激SMMC772l細(xì)胞30min，NFKB就發(fā)生顯著的轉(zhuǎn)核活化(P005)，2h活化達(dá)到高峰，然后開(kāi)始回落，8h

4、已處于低水平的維持狀態(tài)。且NFKB的活化隨TNFn的劑量增加而增加。NFKB亞基p65免疫細(xì)胞化學(xué)顯示：正常培養(yǎng)條件下，胞漿中呈強(qiáng)陽(yáng)性染色；TNFa刺激能誘導(dǎo)p65亞基轉(zhuǎn)核，在30分鐘時(shí)即可觀察到p65亞基明顯的核轉(zhuǎn)位，胞核、胞漿中均有陽(yáng)性染色；l小時(shí)細(xì)胞核中染色呈強(qiáng)餌性，2小時(shí)核中染色達(dá)到高悔。胞漿染色已變得微弱。p65亞基昀核轉(zhuǎn)位也里TNFa劑量依賴關(guān)系。4應(yīng)用20lamol／LTPCK預(yù)處理SMMC7721細(xì)胞30min，加入10