1、丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV)為單股正鏈RNA 病毒，黃病毒科成員，是經血液傳播而引起急、慢性肝炎的主要致病因子之一。目前全球約有1.7億人感染HCV，每年新發(fā)感染者約300萬例。HCV 慢性感染率高達70％以上，HCV慢性感染在發(fā)達國家是導致肝硬化、肝細胞癌等終末期肝病的主要原因。HCV 感染還與多種肝外疾病，如淋巴瘤、混合性冷球蛋白血癥、腎小球腎炎、遲發(fā)性皮膚卟啉癥、糖尿病等密切相關。目前全球范圍內經血

2、液以及血制品途徑感染的丙型肝炎病例與上世紀九十年代以前相比有大幅下降，但在發(fā)展中國家血液和血制品仍然是傳播HCV的重要途徑。此外，每年散發(fā)性以及傳播途徑不明的丙型肝炎新發(fā)病例在全球范圍內仍高居不下。控制HCV感染的關鍵措施還依賴于開發(fā)出有效的疫苗。從1989年HCV基因組被克隆以來，丙型肝炎疫苗的研究在歐美和日本等發(fā)達國家一直是研究熱點，但迄今未有有效的疫苗問世。HCV 包膜E2蛋白是介導HCV細胞侵入的關鍵蛋白，該蛋白氨基末端的27個

3、氨基酸是第一個鑒定出的含中和抗體表位的區(qū)域，因其序列高變而被稱為高變區(qū)1（hypervariable Region 1，HVR1），HVRl的高度變異曾被認為是遏制丙肝疫苗發(fā)展的瓶頸問題。然而，近幾年來基于感染性假HCV 顆粒（HCVpp）以及細胞培養(yǎng)產生的HCV（HCVcc）的中和試驗表明，HVRl并不是唯一的中和抗體表位所在區(qū)域，在HCV包膜E2蛋白中還存在保守的空間構象和線性中和抗體表位。本實驗室之前研究HVR1免疫特性時發(fā)現：H

4、VR1具有強免疫原性，可高效誘導中和抗體，同時，HVR1非常顯著地抑制HCV 包膜E2蛋白中保守抗原表位的抗體應答。本研究中，我們進一步從免疫原性和蛋白結構等方面分析HVR1免疫誘餌作用的可能機制，并鑒定出其中的關鍵氨基酸序列，為認識HCV免疫逃避以及HCV細胞侵入機制提供全新信息，為HCV 疫苗的研究提出全新思路。
　　 一、HVR1中抑制E2蛋白免疫原性的關鍵肽段的鑒定
　　 方法：1、質粒構建：以1a基因型H77株

5、HCV 包膜蛋白基因為原型，構建HVR1中部分氨基酸殘基缺失的各種分泌型E2蛋白表達質粒，包括缺失整個HVR1（77Δ）、缺失HVR1第1至12 位氨基酸殘基（77Δ1-12）、缺失第13 至27 位氨基酸殘基（77Δ13-27）、缺失第16 至24 位氨基酸殘基（77Δ16-24）以及含完整HVR1（77）的5種質粒。2、E2蛋白表達檢測：用ELISA、Western blot和免疫熒光檢測各種E2蛋白的表達和分泌。3、DNA免疫：將

6、上述質粒肌肉注射免疫Balb/C小鼠。4、抗體檢測：用ELISA和免疫熒光檢測小鼠血清中的E2Δ抗體、HVR1抗體以及三個已知B細胞表位（412、522、432）的反應。
　　 結果：缺失HVR1或其中的部分殘基對E2蛋白的表達、分泌及構象無明顯影響。含有HVR1或HVR1第16-24 位氨基酸的質?？擅庖咝∈笳T導產生HVR1抗體，同時抑制E2蛋白中其他表位的抗體應答，而去除第16-24 位氨基酸即可消除這種抑制作用。結論：高變

7、區(qū)1中的16-24 位氨基酸為抑制E2蛋白免疫原性的關鍵肽段，而該肽段是我們前期鑒定出的H77株HVR1中的唯一B細胞表位。
　　 二、HVR1抑制HCV 包膜E2蛋白免疫原性的機制研究
　　 方法：1、構建質粒：將HVR1移位到E2蛋白羧基末端（77Δ-HC）、在E2 羧基末端增加HVR1肽段（77-HC）；將HVR1與HBsAg 串聯（S-HN）；將HVR1替換為其他抗原表位HA表位（77HA）。2、將各重組質粒免疫

8、小鼠。3、檢測小鼠產生的HVR1抗體、HA抗體、E2抗體以及HBsAg抗體，分析各種抗體水平之間的相關性。
　　 結果：1、HVR1的定位不影響其對E2免疫原性的抑制作用。2、HVR1可抑制HBsAg誘導的抗體應答。3、HA表位也能抑制E2的免疫原性。
　　 結論：HVR1是免疫優(yōu)勢表位，可抑制HBsAg的免疫原性；E2蛋白其他區(qū)域的免疫原性易受HVR1以及HA表位的影響，導致誘導抗體的能力降低。
　　 三、免疫

9、血清對病毒的中和作用研究
　　 方法：1、將幾種代表性質粒（77、77Δ、77Δ13-27）用肌肉注射聯合電脈沖免疫新西蘭大白兔。2、檢測兔血清抗體。3、純化兔血清中的IgG，分析IgG對HCVpp 以及HCVcc的中和活性。
　　 結果：1、質粒77能誘導 E2抗體，但其中針對 HVR1的抗體占絕對優(yōu)勢；以E2Δ作為抗原檢測兔血清，則質粒77Δ、77Δ13-27 誘導的抗體顯著強于77；2、用不同基因型 E1E2為抗原

10、檢測兔血清抗體，表明缺失 HVR1能顯著提高 E2蛋白誘導交叉中和抗體；3、HCVpp中和試驗表明，77免疫血清的中和作用主要依賴于 HVR1抗體，缺失 HVR1或HVR1的第13-27 位氨基酸能顯著促進 E2 誘導交叉中和抗體。
　　 結論：免疫兔得到的結果與免疫小鼠得到的結論是一致的，即HVR1顯著抑制 E2蛋白中其他抗體表位的免疫原性，用缺失HVR1或HVR1中第13-27 位氨基酸的E2蛋白可能是一種有效的丙型肝炎疫苗