1、本課題主要目的：
　　 急性肺損傷導致彌漫性的肺血管內(nèi)皮，肺上皮損傷和肺泡毛細血管通透性增加。最近的研究表明外周血來源的內(nèi)皮祖細胞(EPCs)移植治療在維持正常內(nèi)皮細胞功能和修復損傷內(nèi)皮細胞中發(fā)揮重要的作用。本研究的目的是評估自體外周血來源的內(nèi)皮祖細胞移植對油酸和內(nèi)毒素急性肺損傷的保護效應和可能的潛在作用機制。本實驗第一部份旨在從兔外周血分離單個核細胞，在體外定向培養(yǎng)下使其向內(nèi)皮祖細胞分化和擴增。同時，通過內(nèi)皮祖細胞特有細胞表面

2、標志物，以及其特異性的吞噬低密度脂蛋白和特異性結合荊豆凝集素特點來鑒定培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細胞。本研究第二和第三部份分別采用油酸和內(nèi)毒素靜注建立油酸兔急性肺損傷和內(nèi)毒素急性肺損傷模型，通過評估移植自體血來源的內(nèi)皮祖細胞對急性肺損傷的修復效應來分析其對急性肺損傷可能的保護機制。本研究第四部份通過轉(zhuǎn)染hVEGF165基因到內(nèi)皮祖細胞，探討hVEGF165基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞對其在體外粘附，遷移及增殖能力的影響，從而為體內(nèi)移植轉(zhuǎn)hVEGF165基因的內(nèi)

3、皮祖細胞奠定實驗基礎。
　　 本課題主要方法：
　　 1.采用Fi col l 密度梯度離心法成功分離，培養(yǎng)，擴增和鑒定兔外周血來源的內(nèi)皮祖細胞成年雄性新西蘭大白兔，全身麻醉后經(jīng)耳中央動脈采血10ml/ kg，利用Fi col l 密度梯度離心法分離出單個核細胞，在體外定向培養(yǎng)基下進行培養(yǎng)，使其向內(nèi)皮祖細胞方向分化，同時在體外擴增。利用內(nèi)皮祖細胞特有的細胞表面標志物VEGFR2、CD133和CD34，采用免疫熒光和免疫組

4、化進行內(nèi)皮祖細胞鑒定。
　　 通過內(nèi)皮祖細胞吞噬低密度脂蛋白和特異性結合荊豆凝集素特點，采用免疫熒光來證實內(nèi)皮祖細胞。
　　 2.采用油酸靜脈注射建立兔急性肺損傷模型，用自體內(nèi)皮祖細胞移植評價其對急性肺損傷的治療效果成年雄性新西蘭大白兔經(jīng)靜注戊巴比妥鈉麻醉后，80mg/ kg油酸右耳緣靜脈緩注。4小時后，EPCs 移植組從耳緣靜脈注射CM-Di l 熒光標記的EPCs(200ml 生理鹽水含大約106個細胞)，對照組注射

5、等量生理鹽水。各組動物分別于油酸處理前、油酸處理后各個時間點，進行動脈血氣分析并計算PaO2/ Fi O2比值。各組動物分別于油酸處理前、油酸處理后各個時間點，ELISA 法檢測血清VEGF 含量。48小時后處死動物，取雙肺組織標本進行病理檢測，評價肺含水量和肺組織多形核白細胞浸潤情況，計算肺透明膜和出血面積。
　　 3.采用內(nèi)毒素靜脈注射建立兔急性肺損傷模型，用自體內(nèi)皮祖細胞移植評價其對急性肺損傷的治療效果及探討可能的機制新西

6、蘭大白兔經(jīng)耳緣靜脈注射苯巴比妥鈉麻醉后，通過耳靜脈緩慢（超過30分鐘）注射內(nèi)毒素500mg/ kg 制備兔急性肺損傷模型。內(nèi)毒素注射4h后，實驗組靜注500ml 生理鹽水含自體內(nèi)皮祖細胞(約106)，對照組給予同等量生理鹽水靜脈注射。觀察各組動物血氣，肺組織病理改變，檢測血漿NO、MDA 含量和SOD活性，West ern bl ot 檢測肺組織I NOS和VEGF表達情況，ELISA法分析血漿細胞因子IL-1β， E-sel ect

7、I n, ICAM-1和IL-10在損傷肺組織的表達水平。
　　 4．采用人hVEGF165基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞，在體外細胞水平研究基因修飾對內(nèi)皮祖細胞移植粘附，遷移和增殖的影響構建人hVEGF165基因真核表達載體，基因修飾內(nèi)皮祖細胞，在體外檢測hVEGF165基因轉(zhuǎn)染對內(nèi)皮祖細胞粘附，遷移和增殖能力的影響。
　　 本課題主要結果：
　　 1.本實驗采用了一種簡單實用的方法從兔外周血中分離、誘導、并能在體外成功培

8、養(yǎng)、擴增出具有典型特征的EPCs。本實驗采用綜合方法成功鑒定了EPCs，首先從形態(tài)學上，培養(yǎng)7天后細胞呈典型內(nèi)皮祖細胞集落；其次, 我們采用免疫細胞化驗證了內(nèi)皮祖細胞特有的表面標記物CD34、VEGFR2和CD133，同時利用內(nèi)皮祖細胞內(nèi)吞ac-LDL的功能及特異性結合UEA-1的特點，采用細胞熒光化學方法證實從外周血能成功分離和培養(yǎng)出自體EPCs。
　　 2.本研究結果表明：油酸急性肺損傷早期PaO2/ Fi O2比值均顯著降

9、低，自體EPCs 移植后，PaO2/ Fi O2比值逐漸升高，肺功能有明顯改善。急性肺損傷期間，肺血管內(nèi)皮細胞激活，表達粘附分子和趨化大量PMNs的浸潤，肺泡-毛細胞血管膜破壞，蛋白滲透性增加，透明膜形成和肺出血。本實驗結果顯示，自體EPCs 移植后，兔肺含水量明顯降低，肺透明膜面積和出血面積顯著減少，PMN 率計算顯示肺組織PMN 浸潤數(shù)量也明顯減少。本研究也探討了EPCs 移植后兔血清VEGF 含量的變化，與對照組比較，EPCs組血

10、清VEGF 含量在移植后逐漸升高，驗證了EPCs 除了直接的細胞補丁效應外，還能分泌VEGF等細胞因子，通過旁分泌的方式刺激損傷周圍內(nèi)皮細胞自我修復和再生。本研究利用熒光示蹤技術追蹤和定位了EPCs在肺血管壁的歸巢和整合，表明EPC 靜脈注射后到損傷的肺血管內(nèi)皮參與修復和重建。
　　 3.本研究結果表明內(nèi)毒素急性肺損傷后，PaO2/ Fi O2比值均顯著降低，EPCs 移植輸注后能明顯增加其比值。與生理鹽水對照組比較，自體EPC

11、s 移植后能明顯降低多形核白細胞在肺組織的浸潤數(shù)量，肺水含量和透明膜形成面積和肺出血面積也顯著減少。
　　 血漿NO和MDA的含量明顯減少，SOD 活性卻顯著增強。在損傷肺組織，自體EPCs 處理后，致炎因子IL-1β， E-sel ect I n和ICAM-1表達水平明顯降低，而抗炎細胞因子IL-10表達水平卻明顯增加。
　　 同時，EPCs 移植治療后，損傷肺組織VEGF的表達水平明顯增加，而I NOS表達水平卻降低

12、。
　　 4．hVEGF165基因在體外能成功轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞，轉(zhuǎn)染的EPCs能表達VEGF蛋白，hVEGF165基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞后能明顯促進其增殖、遷移和粘附能力。
　　 本課題主要結論如下：
　　 1.本實驗從兔外周血中成功分離、并在體外定向培養(yǎng)、擴增出具有典型特征的內(nèi)皮祖細胞，與骨髓來源內(nèi)皮祖細胞相比較，從自體外周血分離和培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞，有取材方便，對機體損害小，細胞來源不受限制，無倫理方面的爭論，且細胞純

13、度高的優(yōu)點。
　　 2.外周血來源內(nèi)皮祖細胞自體移植能有效地保護油酸誘導的急性肺損傷，從而為內(nèi)皮祖細胞自體移植治療急性肺損傷提供新的策略。
　　 3.自體內(nèi)皮祖細胞移植能部份修復肺內(nèi)皮功能，有效地減輕內(nèi)毒素誘導的急性肺損傷，其保護機制可能與直接通過內(nèi)皮細胞的修補作用和間接發(fā)揮旁分泌效應及抗氧化和抗炎效應，為進一步探討內(nèi)皮祖細胞對急性肺損傷的保護作用提供新的思路。
　　 4．內(nèi)皮祖細胞能成功轉(zhuǎn)染hVEGF165基因