1、柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16，CA16)屬小RNA病毒科、腸道病毒屬，是引起嬰幼兒手足口病(Hand，foot，and mouth disease，HFMD)的主要病原體之一，在全球范圍內(nèi)曾出現(xiàn)多次大規(guī)模爆發(fā)流行。CA16感染引起的主要臨床癥狀包括手、足、口部皰疹等，多數(shù)病例較輕并具有自限性，但也存在少量個別病例出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦干腦炎、肺水腫和肺出血等重癥并導(dǎo)致死亡。疫情的爆發(fā)已經(jīng)成為危害嬰幼兒健康的重

2、大社會公共衛(wèi)生問題，目前臨床上仍缺乏防治CA16感染的特效藥物和疫苗，因此對于CA16病原學(xué)特征的深入研究顯得尤為重要。利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建感染性克隆解決了RNA病毒基因組難以操作的問題，是在cDNA水平上研究RNA病毒的有力工具，能夠在體外對病毒基因組進(jìn)行突變、缺失、嵌合等操作后，由感染性克隆體外轉(zhuǎn)錄獲得病毒基因組RNA，并轉(zhuǎn)染易感細(xì)胞可獲得拯救病毒，通過對比這些操作其表型、性狀變化的影響，為研究RNA病毒的基因的結(jié)構(gòu)與功能、病毒復(fù)

3、制機(jī)制和致病機(jī)理提供嶄新的途徑。
　　首先構(gòu)建了CA16（G20株）基因組全長cDNA感染性克隆。以病毒基因組RNA為模板擴(kuò)增得到CA16基因組全長cDNA，并將其通過TOPO-TA克隆進(jìn)入載體。利用T7聚合酶系統(tǒng)以線性化的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到CA16病毒基因組RNA，并將CA16基因組RNA轉(zhuǎn)染Vero獲得拯救病毒，經(jīng)基因組序列分析、RT-PCR、免疫熒光和透射電鏡鑒定，確定拯救病毒為柯薩奇病毒A組16型。CA16

4、拯救病毒的蝕斑形態(tài)、體外增殖動力學(xué)曲線和乳鼠感染致病特征與其母本CA16野生型病毒基本一致，良好地保留了母本病毒的生物學(xué)性狀、增殖特性和動物感染與致病特征。
　　在成功構(gòu)建CA16基因組全長cDNA感染性克隆并獲得CA16拯救病毒的研究基礎(chǔ)上，利用反向遺傳學(xué)方法將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)EG基因通過融合PCR插入上述CA16病毒的基因組的5'UTR和VP4

5、基因之間中，并在EGFP基因和VP4基因之間引入2A蛋白酶切割位點(diǎn)，成功構(gòu)建了EGFP嵌合CA16基因組全長cDNA感染性克隆。經(jīng)基因組序列分析、RT-PCR、Western blot、免疫熒光和透射電鏡鑒定以及體外Real-timePCR、熒光強(qiáng)度觀察、熒光定量分析和動物體內(nèi)組織冰凍切片熒光觀察確定，成功獲得了一株表達(dá)綠色熒光蛋白報(bào)告基因的EGFP嵌合CA16拯救病毒。通過熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)情況就可以直觀指示病毒的生長情況。

6、EGFP嵌合CA16拯救病毒的蝕斑形態(tài)、體外增殖動力學(xué)曲線和乳鼠感染致病特征與其母本CA16野生型病毒基本一致，但通過對感染乳鼠的生存率、相關(guān)組織病毒載量和病理改變的分析后發(fā)現(xiàn)，EGFP嵌合CA16拯救病毒的乳鼠致病性較CA16野生型病毒略低。
　　綜上所述，本研究利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，通過構(gòu)建CA16感染性克隆和EGFP嵌合CA16感染性克隆并獲得拯救病毒，為進(jìn)一步研究CA16病毒基因功能，尋找病毒毒力位點(diǎn)，檢測病毒對細(xì)胞的感染情