1、目的：
　　本研究通過利用體外Transwell小室培養(yǎng)法模擬的單層腸上皮模型和體內(nèi)硫酸葡聚糖鈉(Dextran sodium sulfate，DSS)誘導(dǎo)構(gòu)建的腸上皮屏障缺陷小鼠模型，探討了Sdc1與緊密連接蛋白的相互作用在腸上皮屏障功能維護中的作用;并進一步揭示了轉(zhuǎn)錄因子Stat3在這一過程中的介導(dǎo)作用。
　　方法和結(jié)果：
　　1.篩選Sdc1不同表達水平的腸上皮細胞，構(gòu)建單層腸上皮屏障模型
　　采用跨膜電阻

2、儀檢測上皮跨膜電阻(TEER)來評價上皮屏障的完整性，在大腸桿菌刺激后檢測細菌易位，通過熒光素FITC-dextran(FD4)的旁細胞轉(zhuǎn)運評價上皮屏障的通透性。結(jié)果顯示:在Transwell小室底部內(nèi)側(cè)培養(yǎng)細胞15d之后，TEER值顯著升高，約為300 ohmscm2，證明單層腸上皮屏障形成。大腸桿菌刺激后，以處理前TEER值為對照，TEER實測值的絕對值及其與處理前TEER值的比值均呈現(xiàn)時間依賴性的減少，而在未被細菌處理的上皮屏障中

3、TEER值基本維持穩(wěn)定。在Caco-2細胞構(gòu)建的單層上皮屏障中，TEER值減少更加顯著（F=49.030，P＜0.001），大腸桿菌的易位量（t=8.373，P=0.001）和FD4的透過量（t=9.689，P=0.001）也均較HT29細胞更加顯著。
　　2.Sdc1能緩解大腸桿菌刺激后的屏障功能受損及細菌易位
　　利用慢病毒載體將外源性的Sdc1導(dǎo)入Caco-2細胞，經(jīng)過2周左右2μg/mLpuromycin篩選，建立了

4、Sdc1表達顯著升高的細胞克隆，通過熒光定量PCR和Western blot對細胞克隆進行鑒定。結(jié)果顯示Sdc1在mRNA(t=14.381，P＜0.001)和蛋白水平均顯著增加。利用Lipofectmine2000瞬時轉(zhuǎn)染Sdc1 siRNA進入HT29細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，Sdc1在mRNA(t=56.292，P＜0.001)和蛋白的表達水平均顯著降低。
　　3.Sdc1能緩解金黃色葡萄球菌刺激后的屏障功能受損及細菌易位

5、>　　利用金黃色葡萄球菌刺激上述已經(jīng)構(gòu)建好的單層上皮屏障。結(jié)果顯示，刺激5h后，與對照組相比，高表達Sdc1的Caco-2細胞的TEER值減低率(F=129.269，P＜0.001)和葡萄球菌易位(F=39.479，P＜0.001)均顯著減少;而敲低Sdc1表達的HT29細胞中，TEER值減低率（F=124.132，P＜0.001）和葡萄球菌易位(F=51.965，P=0.001)均顯著增加，均與大腸桿菌刺激屏障后的結(jié)果一致。以上結(jié)果提

6、示Sdc1對上皮屏障功能的保護作用并非呈刺激細菌依賴性，而可能是一種對各種細菌-上皮作用普遍存在的現(xiàn)象。
　　4.Sdc1能夠減輕緊密連接蛋白缺陷細胞的屏障功能受損
　　HT29細胞單獨轉(zhuǎn)染ZO-1 siRNA后，ZO-1蛋白表達水平顯著下降，若在此基礎(chǔ)上同時給予Sdc1慢病毒載體處理使Sdc1表達水平升高，就能夠顯著減弱ZO-1蛋白的下降程度。結(jié)果顯示:在HT29細胞單獨轉(zhuǎn)染ZO-1 siRNA下調(diào)ZO-1蛋白表達水平后，

7、與對照組相比，單層上皮屏障的TEER值減低率(F=138.489， P＜0.001)、大腸桿菌易位（t=11.624，P＜0.001）、FD4透過值（t=14.802，P＜0.001）均顯著升高。若同時給予Sdc1慢病毒載體處理使ZO-1沉默作用被減輕，上述指標升高的程度均有所減少，提示受損的屏障功能被部分恢復(fù)，Sdc1可能對ZO-1蛋白缺陷的細胞具有保護作用。
　　5.Sdc1能夠緩解小鼠體內(nèi)DSS誘導(dǎo)的屏障缺陷及細菌易位

8、>　　利用DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的方法構(gòu)建腸粘膜屏障缺陷小鼠模型，通過尾靜脈注射Sdc1高表達質(zhì)粒的方法進行體內(nèi)轉(zhuǎn)染，上調(diào)Sdc1表達，之后評估腸粘膜緊密連接蛋白表達及超微結(jié)構(gòu)、組織細菌易位、腸粘膜組織病理學(xué)變化等相應(yīng)屏障功能的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn):PBS對照組小鼠一般情況及大便性狀均無顯著變化，DAI評分為0;組織病理學(xué)檢查和緊密連接超微結(jié)構(gòu)亦無顯著改變。小鼠飲用DSS溶液3-5天后逐漸出現(xiàn)腹瀉、不同程度的稀便至血便等癥狀，DAI評分升高（F=5

9、59.328，P＜0.001），結(jié)腸縮短。
　　提取不同處理組小鼠腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾組織樣本的基因組DNA進行熒光定量PCR檢測，計算其中的細菌含量。以上結(jié)果提示Sdc1能夠抑制體內(nèi)屏障缺陷模型的細菌易位。
　　6.Sdc1與緊密連接蛋白ZO-1、occludin在細胞中的表達及分布相似
　　利用免疫熒光染色從細胞水平觀察Sdc1與ZO-1、occludin的細胞內(nèi)定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sdc1和ZO-1、occludin分

10、布位置相似，均以細胞膜上分布為主。Caco-2細胞上調(diào)Sdc1表達后，Western blot檢測結(jié)果提示ZO-1和occludin的表達水平均升高;HT29細胞敲除Sdc1表達后，ZO-1和occludin的表達水平也均有一定程度的降低。
　　7.Sdc1通過激活Stat3信號通路調(diào)控ZO-1和occludin的表達
　　通過感染帶有Stat3顯性負性突變型質(zhì)粒的慢病毒載體阻斷Stat3的轉(zhuǎn)錄活性后，細胞中ZO-1和occ

11、ludin的表達水平均減少(P＜0.001)。如果在阻斷Stat3轉(zhuǎn)錄活性同時再感染Sdc1慢病毒載體上調(diào)Sdc1表達，Sdc1對ZO-1和occludin的表達調(diào)控作用就被削弱，提示Sdc1是通過Stat3通路的介導(dǎo)從而發(fā)揮對ZO-1和occludin的調(diào)控作用的。
　　8.Stat3信號通路參與Sdc1對腸上皮屏障功能的維護
　　在細胞中阻斷Stat3轉(zhuǎn)錄活性的同時上調(diào)Sdc1的表達水平，檢測Sdc1表達水平改變前后腸上

12、皮單層屏障模型的功能變化。結(jié)果提示:單獨阻斷Stat3的轉(zhuǎn)錄活性，單層上皮屏障功能受損，表現(xiàn)為TEER值下降（F=83.270，P＜0.001），大腸桿菌易位(t=3.954，P=0.017)及FD4透過增加（t=11.143，P＜0.001）。盡管Sdc1能夠維持細胞的TEER值在較高水平，抑制細菌易位和FD4的跨膜轉(zhuǎn)運，但當Stat3通路被阻斷時，Sdc1的上述保護作用就被削弱。
　　9.Stat3能直接結(jié)合ZO-1和occl

13、udin的啟動子
　　生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn):在人類ZO-1和occludin基因及其轉(zhuǎn)錄起始位點上游約10 kb以內(nèi)的DNA序列中，可以找到多個類似Stat3結(jié)合核心序列(TTCCGGAA)的DNA序列，被認為是潛在的Stat3的DNA結(jié)合位點，隨后利用ChIP實驗驗證其是否位于ZO-1或occludin的啟動子區(qū)域。結(jié)果提示:在ZO-1轉(zhuǎn)錄起始位點上游-199～-208 bp、-394～-404 bp處，occludin轉(zhuǎn)錄起始位

14、點上游-4458～-4469 bp、-5385～-5394 bp、-7056～-7066 bp處分別找到若干個與Stat3分子DNA結(jié)合序列最相似的序列，ChIP-PCR顯示ZO-1和occludin基因的啟動子序列通過Stat3-ChIP得到了富集(P＜0.05)，證明Stat3可以與ZO-1和occludin的啟動子結(jié)合。當Caco-2細胞高表達Sdc1時，Stat3向ZO-1和occludin啟動子區(qū)域的募集顯著增加(P＜0.01

15、)。在HT29細胞中敲除Sdc1后，Stat3的募集相對減少(P＜0.01)。這些結(jié)果表明，Sdc1能夠激活Stat3分子發(fā)生磷酸化，Stat3能夠直接靶向結(jié)合ZO-1和occludin的啟動子，三者表達水平呈正相關(guān)。
　　10.ZO-1與occludin具有相互作用，反饋調(diào)節(jié)Sdc1表達
　　Co-IP實驗提示免疫沉淀的ZO-1復(fù)合體中可以檢測到occludin蛋白的存在，同樣，在免疫沉淀的occludin復(fù)合體中也可以檢

16、測到ZO-1蛋白的存在;而ZO-1和occludin與作為陰性對照的IgG蛋白不發(fā)生任何結(jié)合作用，表明ZO-1和occludin二者能夠發(fā)生相互作用，構(gòu)成免疫復(fù)合體。在HT29細胞中，敲除ZO-1或occludin蛋白，Sdc1的表達水平呈反饋性增加。提示三者可能構(gòu)成負反饋環(huán)路，共同參與對腸上皮屏障功能的維持。
　　結(jié)論：
　　1、Sdc1對腸上皮屏障的維護具有保護作用，表現(xiàn)為能夠顯著穩(wěn)定上皮的完整性、抑制細菌易位和降低跨膜

17、轉(zhuǎn)運的通透性;
　　2、Sdc1能夠在體外提高緊密連接蛋白缺陷細胞的單層上皮屏障功能;
　　3、Sdc1能夠在體內(nèi)緩解DSS誘導(dǎo)的屏障缺陷及細菌易位;
　　4、Sdc1與緊密連接蛋白ZO-1、occludin在細胞中的表達同步、分布相似;
　　5、Sdc1能夠激活Stat3信號通路，磷酸化的Stat3直接結(jié)合ZO-1和occludin的啟動子區(qū)域，調(diào)控ZO-1和occludin的轉(zhuǎn)錄，從而參與Sdc1對屏障功能的