1、先天性馬蹄內翻足(idiopathic congenital clubfoot，CCF)是常見的嚴重危害兒童健康的先天畸形之一，發(fā)病率在1～4.5％。遺傳因素在CCF的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，遺傳度為65％。但其遺傳方式、外顯率等均不清楚，易感基因尚未確定。目前研究較多的與CCF發(fā)病相關的基因主要集中在與足踝部的骨骼、軟骨、肌肉和神經發(fā)育相關的基因，如COL9A1，CASP10，WNT7A，HOXD13等。 我室前期應用ETDT

2、方法對84個CCF核心家系HOXD基因簇內的4個多態(tài)位點進行分析，提示HOXD13基因可能是先天性馬蹄內翻足的易感基因。HOX基因家族是一個高度保守的轉錄因子家族，該家族在胚胎發(fā)育階段基本體軸和次級體軸的形成中起作用，所有的HOX蛋白都是通過一個60個氨基酸的DNA結合基序來結合特定的DNA序列而發(fā)揮其轉錄調控作用。Hoxd13參與的遺傳通路，特別是受其影響的下游靶基因目前還不清楚。有研究表明，Hoxd13可以激活小鼠成纖維細胞中Sli

3、m1基因的表達，提示Hoxd13可能調控Slim1的表達。本實驗進一步探討HOXD13，SLIM1與先天性馬蹄內翻足的關系以及Hoxd13在大鼠胚胎肢體發(fā)育中調控Slim1的機制。 方法： 標本：84例CCF患者外周靜脈血和15例CCF患者肌肉組織標本由中國醫(yī)科大學附屬第二臨床醫(yī)院小兒外科提供，3例同年齡組的正常人足部肌肉組織由中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院提供。所有標本使用均經患者知情并同意。成年SD大鼠購自中國醫(yī)科大學實驗動物

4、中心，所有的實驗過程都遵照動物保護條例。 1、變性梯度凝膠電泳技術檢測HOXD13基因編碼區(qū)的突變PCR擴增84例患者HOXD13基因全部2個外顯子，應用20％～80％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳篩查2個外顯子的突變情況。 2、半定量RT-PCR，免疫組織化學和Western-blot方法研究HOXD13和SLIM1基因在CCF患者肌肉組織中的表達分別提取CCF患者及正常人肌肉組織的RNA和蛋白質，應用半定量RT-PCR和W

5、estern-blot檢測HOXD13和SLIM1基因的表達；分別制各CCF患者及正常人肌肉組織的常規(guī)石蠟包埋切片，應用免疫組織化學方法檢測HOXD13和SLIM1基因的表達。 3、Western-blot和免疫熒光檢測孕12.5天的大鼠胎鼠下肢肢芽中Hoxd13和Slim1的表達應用Western-blot技術檢測孕12.5天的大鼠胎鼠下肢肢芽中Hoxd13和Slim1的表達，應用免疫熒光檢測12.5天的大鼠胎鼠下肢肢芽中Ho

6、xd13和Slim1基因表達的組織定位。 4、在大鼠L6GNR4細胞系中外源表達HOXD13后觀察Slim1基因表達構建HOXD13的真核細胞表達載體pcDNA-HOXD13，轉染大鼠L6GNR4細胞后觀察Slim1基因表達水平的改變。 5、應用P-MATCH軟件預測了大鼠Slim1基因5’上游序列轉錄因子的結合位點獲取 Slim1 基因5’上游1500bp序列信息(http：//www.ensembl.org)，應用P

7、-MATCH軟件預測其轉錄因子結合位點。 6、熒光素酶報告基因系統(tǒng)PCR擴增Slim1基因啟動子序列，構建熒光素酶報告載體pGL3-Slim1。pGL3-Slim1和pcDNA-HOXD13轉染大鼠L6GNR4細胞，觀察HOXD13對Slim1的轉錄調控作用。 7、凝膠阻滯實驗孕12.5天胎鼠下肢肢芽組織核蛋白和3’生物素標記的探針(含有位點2)在凝膠阻滯緩沖液中室溫結合1小時，10％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜、紫外交聯

8、后，應用化學發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測結果。 8、染色質免疫沉淀實驗提取L6GNR4細胞和孕12.5天胎鼠下肢肢芽和腦組織的染色質，甲醛交聯、酶切后應用Hoxd13抗體進行沉淀，沉淀下來的染色質通過PCR擴增檢測結果。 結果： 1、在84例CCF患者外周靜脈血中未發(fā)現HOXD13基因的編碼區(qū)突變。 2、CCF患者肌肉組織中存在HOXD13(5/15，33.3％)和SLIM1(7/15，46.7％)基因的表達下調。

9、 3、在孕12.5天的胎鼠下肢肢芽中Hoxd13和Slim1共表達在趾間組織。 4、外源表達HOXD13可明顯激活大鼠成肌細胞L6GNR4中Slim1基因的表達。 5、在大鼠Slim1基因啟動子區(qū)域存在2個Hoxd13的可能結合位點，分別命名為Hoxd13結合位點1(-1164～1158)和HoXd13結合位點2(-1140～1134)。 6、Hoxd13通過和Hoxd13結合位點2結合發(fā)揮轉錄調控作用。

10、 L6GNR4細胞瞬時轉染了pGL3-Slim1(-1185)熒光素酶報告基因表達載體和HOXD13表達載體后，HOXD13可以明顯提高熒光素酶活性。我們又構建了缺失型的pGL3-Slim1(-1154)熒光素酶報告基因的表達載體，轉染后的熒光素酶活性與轉染pGL3-Slim1(-1185)比較，HOXD13同樣可以明顯提高熒光素酶活性。我們改變了Hoxd13結合位點2的核心序列，構建了pGL3-Sliml(-1154m)表達載體

11、，轉染L6GNR4細胞后發(fā)現當Hoxd13結合位點2突變后HOXD13對熒光素酶活性無影響。綜合以上結果，說明Hoxd13結合位點2可能是HOXD13的結合位置。 7、在體外HOXd13蛋白可以和Sliml基因啟動子區(qū)位點2直接結合。 EMSA結果表明當Hoxd13蛋白質存在時出現阻滯的DNA-蛋白質復合體，當加入Hoxd13抗體時出現超阻滯條帶。證明在體外Hoxd13和預測的Hoxd13結合位點2可以直接結合。

12、 8、在孕12.5天大鼠胚胎肢體發(fā)育過程中HOXd13可以和Slim1基因啟動子區(qū)Hoxd13結合位點2直接結合。 我們應用染色質免疫沉淀技術驗證在體內Hoxd13和Slim1基因上游序列的結合作用。沉淀的L6GNR4細胞染色質中有Hoxd13結合位點2的擴增，無對照位點的擴增。為進一步驗證在胚胎肢體發(fā)育過程中Hoxd13是否和Slim1啟動子結合，我們以孕12.5天的大鼠下肢肢芽組織為研究對象進行了染色質免疫沉淀實驗，沉淀的肢

13、芽染色質有Hoxd13結合位點2的擴增，無對照位點的擴增，而在對照腦組織中沒有Hoxd13結合位點2的擴增。實驗結果表明在大鼠胚胎肢體發(fā)育過程中Hoxd13蛋白可以和Slim1啟動子區(qū)的Hoxd13結合位點2結合發(fā)揮其轉錄調節(jié)作用。 結論： 1、HOXD13基因的編碼區(qū)突變可能不是CCF發(fā)病的原因。 2、HOXD13基因和SLIM1基因的表達下調可能與CCF畸形的發(fā)生有關。 3、在大鼠胚胎肢體發(fā)育過程中H