1、本實驗分為兩個部分，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測人血清HSP60及HSP60抗體水平，探討其與冠心病的相關(guān)性并闡述其臨床意義；體外培養(yǎng)人PBMC來源DC，用不同濃度HSP60刺激，從觀察形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞表型、細(xì)胞因子分泌及刺激T淋巴細(xì)胞增殖功能等幾個方面的變化來了解DC的成熟過程和免疫功能的變化，從而為HSP60對DC的成熟及免疫功能的影響提供了實驗依據(jù)，也為臨床防治CHD提供新的靶點。　　 目的:　　 1、探討HSP60與

2、冠心病的相關(guān)性及其臨床意義?！　?2、探討HSP60對人PBMC來源的DCs成熟及免疫功能的影響?！　?對象與方法： 1.從南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院2007年1月到2007年8月心內(nèi)科住院患者中入選96例研究對象，分為冠心?。–HD）組（包括急性冠脈綜合征（ACS）組、穩(wěn)定性心絞痛（SAP）組）、胸痛綜合征（CPS）組、正常對照（Controls）組（各組性別、年齡、高危因素等匹配）。每例抽血10 ml離心取血清

3、，用ELISA方法分別測定血清Hu-HSP60和Hu-HSP60 Ab濃度。 2.門診體檢健康人24例，男性12例，女性12例，年齡（20-23歲）。取其外周血20ml。 2.1 DC的培養(yǎng)及干預(yù)：淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離出外周血單個核細(xì)胞（PBMC），PBS洗3次后，37℃、5％CO2貼壁2h，收集懸浮細(xì)胞，用作分離T淋巴細(xì)胞，貼壁細(xì)胞用完全RPMI1640（含10％FCS，rhGM-CSF 100萬單位/L，

4、rhIL-4 100萬單位/L）培養(yǎng)液，37℃、5％CO2溫箱培養(yǎng)，隔天半量換液，每次換液均保留細(xì)胞懸液直至第7天，培養(yǎng)過程中以倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 2.2 PBTC純化與培養(yǎng)：將上述收集的懸浮細(xì)胞用尼龍毛柱法純化、加入一定量的RPMI-1640培養(yǎng)液（不含雙抗，即青霉素和鏈霉素）和10％胎牛血清，混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度在1×106～1.5×106/ml之間。取0.1ml用血細(xì)胞自動分析儀計數(shù)，淋巴細(xì)胞提取率在80％～95

5、％之間。并取少許用臺盼藍(lán)染色，記數(shù)活細(xì)胞不低于95％；并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定。 2.3 實驗分組及細(xì)胞處理將上述2.2培養(yǎng)第7天的細(xì)胞分為4組。4組均孵育48小時后保留細(xì)胞懸液，收集DC細(xì)胞。 2.4 形態(tài)觀察培養(yǎng)3、5、7和9天，用倒置顯微鏡觀察DC形態(tài)。 2.5 流式細(xì)胞學(xué)（FACS）分析：收集DC細(xì)胞，按照說明書分別檢測DC表面表型CD1α、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表達(dá)情況。 2

6、.6 DCs培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子IL-12測定：收集各組DC細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒說明操作進(jìn)行IL-12檢測。 2.7 混合T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)：以前述2.2法用T淋巴細(xì)胞柱分離出T淋巴細(xì)胞，用RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，加入96孔板，每孔100ul。將2.4中處理后收集的各組DCs經(jīng)絲裂霉素（150umol/L）于37℃處理1小時，懸于完全培養(yǎng)基，按1：50 and 1：20

7、不同DCs：T細(xì)胞比例加入96孔板與T淋巴細(xì)胞混合，總體積200ul。每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)96小時后，加入3H-TDR 2μCi/ml和維生素C 50mg/L，12h后吸棄上清液，二蒸水沖洗，加10％三氯乙酸洗5min，加0.3M NaOH處理30min，多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞至玻璃纖維濾紙上，烤干。烘干后取各孔已收集了細(xì)胞的濾紙置于閃爍計數(shù)管中，每管加入閃爍液0.5ml，密封后用液態(tài)閃爍計數(shù)儀測定放射性。結(jié)果以每分鐘放射計數(shù)（cpm）

8、值表示?！　?結(jié)果： 1.1 結(jié)果：Hu-HSP60水平CHD組明顯高于CPS組和Controls組（P<0.01）；ACS組明顯高于SAP組（P<0.01），SAP組與Controls組和CPS組之間無顯著性差異（P>0.05）；血清Hu-HSP60 Ab水平CHD組明顯高于CPS組和Controls組（P<0.01），ACS組明顯高于SAP組（P<0.01），SAP組明顯高于Controls組和CPS組（P<0.01

9、），Controls組和CPS組無顯著性差異（P>0.05）； 1.2 血清Hu-HSP60及Hu-HSP60 Ab濃度水平分別是預(yù)測ACS的獨立危險因素。 1.3 血清Hu-HSP60與Hu-HSP60 Ab水平呈正相關(guān)（r=0.804，P<0.01） 2.1 DC形態(tài)學(xué)上的觀察：倒置相差顯微鏡觀察，DC培養(yǎng)72小時后：貼壁細(xì)胞聚集成為散在分布、類似克隆的細(xì)胞聚體，聚體不斷增大；第5天后：細(xì)胞始懸浮生長，第7天

10、后：大部分細(xì)胞懸浮或半貼壁，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞團(tuán)逐漸分開，細(xì)胞質(zhì)更加豐富。臺盼藍(lán)染色細(xì)胞活力大于95％；在處理組培養(yǎng)液中加入不同劑量HSP60，對照組加入PBS，繼續(xù)共培養(yǎng)48h，倒置顯微鏡觀察：PBS組細(xì)胞成簇生長，細(xì)胞形態(tài)橢圓形，細(xì)胞核似蠶豆?fàn)?，毛刺狀不明顯；LHC組、MHC組、HHC組可見細(xì)胞成簇生長，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)豐富，周邊成毛刺狀，三組無明顯差別。 2.2 各組人PBMC來源的DCs表型檢測結(jié)果：收集干預(yù)48h

11、的懸浮細(xì)胞，經(jīng)FACS分析顯示：各組CD1α、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的陽性率分別兩兩組間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），PBS組CD1α、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的陽性率分別為（9.133±2.241）％、（33.233±3.947） ％、（42.450±3.880）％、（36.350±6.155）％、（50.983±8.397）％；LHC組分別為（21.350±3.985）％、（43.450

12、±3.729）％、（53.667±3.750）％、（45.350±5.102）％、（62.583±3.089）％，均明顯高于PBS組（均P<0.01）；MHC組分別為（43.733±6.403）％、（66.583±4.390）％、（76.950±4.651）％、（57.483±5.649）％、（76.417±6.074）％，均明顯高于PBS組（均P<0.01）和LHC組（均P<0.01）；HHC組分別為（65.233±3.821）％、（

13、85.900±4.907）％、（95.083±2.398）％、（81.600±7.816）％、（94.750±6.968）％，亦分別明顯高于PBS組（均P<0.01）、LHC組（均P<0.01）和MHC組（均P<0.01）。說明HSP60能增強人PBMC來源DEs的表面黏附共刺激分子CD1α、C080、CD83、CD86、HLA-DR等的表達(dá)，而且這種作用呈劑量依賴性。 2.3 DCs培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子IL-12檢測結(jié)果：收集各

14、組細(xì)胞上清液中進(jìn)行IL-12檢測，4組細(xì)胞上清液中IL-12含量差異存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），分別為PBS組（30.567±28.815）pg/ml；LHC組（94.783±48.887）pg/ml，明顯高于PBS組（P<0.05）；MHC組為（158.880±54.119）pg/ml，明顯高于PBS組（均P<0.05）和LHC組（均P<0.05）；HHC組為（226.480±68.057）pg/ml亦明顯高于PBS組（均P<

15、0.01）。說明HSP60能增加人PBMC來源DCs的IL12的分泌，而且這種作用呈劑量依賴性。 2.4 各組DCs的同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)：DCs在與T淋巴細(xì)胞混合比例在1：50、1：20時，各組3H-TDR摻入率兩兩組間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），PBS組1：50、1：20摻入每分鐘放射計數(shù)（cpm）值分別為（943.830±192.198）cpm、（1848.800±276.100）cpm；LHc組分別為（1298

16、.000±112.727）cpm、（2545.500±218.084）cpm，均分別明顯高于PBS組（均P<0.01）：MHC組分別為（1989.500±132.148）cpm、（3840.500±314.423）cpm，均分別明顯高于PBS組（均P<0.01）和LHC組（均P<0.01）；HHC組分別為（2559.700±156.468）cpm、（5063.500±325.783）cpm，亦分別明顯高于PBS組（均P<0.01）、LH

17、C組（均P<0.01）和MHC組（均P<0.01）。說明HSP60能增強人PBMC來源DCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力，且這種作用存在劑量依賴性?！　?結(jié)論： 1、血清Hu-HSP60、Hu-HSP60 Ab水平與CHD有明顯相關(guān)性，且與ACS的發(fā)生密切相關(guān)，是預(yù)測ACS的獨立危險因素，檢測血清Hu-Hsp60及Hu-Hsp60 Ab水平將有助于CHD的診斷和ACS的預(yù)測。Hu-HSP60、Hu-HSP60 Ab可能參加了