1、肺動脈高壓（Pulmonary artery hypertension，PAH）以肺動脈壓力升高為主要特征，其基本病理改變是肺血管舒縮功能的改變和肺血管重構(gòu)。近年來，有關(guān)肺動脈高壓發(fā)病機制、治療策略的研究和開發(fā)逐漸成為基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)共同關(guān)注的熱點。流行病學(xué)資料顯示：高原動物和世居人較平原動物和人對缺氧環(huán)境具有更強的適應(yīng)能力，這種現(xiàn)象的重要原因之一就是其肺血管對缺氧的收縮反應(yīng)較弱，此即高原缺氧適應(yīng)—習(xí)服機制之肺血管低反應(yīng)性機制。由此，我們

2、考慮，適度缺氧適應(yīng)可能在某種程度上對于以肺血管舒縮功能改變?yōu)橹饕±砩硖卣髦坏姆蝿用}高壓具有一定的遏制作用。慢性間歇性低壓低氧（CIHH）指人或動物在一定時間內(nèi)間斷暴露于低壓低氧環(huán)境內(nèi)（模擬高原環(huán)境低氧），而其余時間暴露于常氧環(huán)境。已有研究表明CIHH對包括心血管系統(tǒng)在內(nèi)的機體的多種組織、器官具有保護作用，并表現(xiàn)抗高血壓效應(yīng)，但目前尚無CIHH對PAH作用的研究報道。本研究以野百合堿（MCT）誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓為模型觀察CIHH對

3、肺動脈高壓的預(yù)防作用，并通過微血管張力測定、免疫組化、免疫熒光、流式細胞術(shù)、ELISA、Western blot和qPCR等方法從整體、器官、組織、細胞、分子和基因水平探討CIHH預(yù)防MCT誘導(dǎo)肺動脈高壓的可能機制，以驗證我們的假說：CIHH可通過增強肺小動脈舒張發(fā)揮預(yù)防PAH作用。本研究分為三個部分：
　　第一部分：慢性間歇性低壓低氧對野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的預(yù)防作用。
　　目的：明確CIHH對MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓

4、的預(yù)防作用。
　　方法：大鼠隨機分為四組：正常對照組（CON）、肺動脈高壓組（PAH）、間歇性低壓低氧處理組（CIHH）、間歇性低壓低氧預(yù)處理+肺動脈高壓組（CIHH+MCT）。CIHH組大鼠置于低壓低氧艙中，接受相當(dāng)于海拔5000 m高度、28天、每天6小時的低壓低氧處理，其余時間置于常氧環(huán)境。PAH組大鼠單劑量腹腔注射MCT（60 mg/kg）14天后造成PAH模型。CIHH+MCT組接受28天的 CIHH處理后單劑量腹腔注射

5、 MCT（60 mg/kg），14天后進行實驗。每周定時測量各組動物的體重和血壓。導(dǎo)管法測定肺血流動力學(xué)指標(biāo)，光鏡下觀察肺組織和肺小動脈結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果：⑴CIHH處理對正常大鼠基礎(chǔ)血壓、心率和體重?zé)o影響（P>0.05），但可對抗PAH大鼠心率的加快和體重的降低（P<0.05）。⑵與CON組大鼠相比，PAH組大鼠mPAP顯著升高（P<0.01）；CIHH組、CIHH+MCT組大鼠mPAP與CON組大鼠無顯著差異（P>0.05

6、）。⑶PAH組大鼠右心室肥厚指數(shù)（ RVHI）明顯高于其他三組大鼠（P<0.01）；CON組、CIHH組、CIHH+MCT組大鼠之間RVHI無顯著性差異（P>0.05）。⑷組織切片光鏡下可見，CIHH組和CON組大鼠肺動脈管壁結(jié)構(gòu)清楚，厚度正常；PAH組大鼠肺小動脈管壁明顯增厚，血管管腔狹窄甚至閉塞；CIHH+MCT組大鼠肺小動脈僅輕度增厚，程度明顯輕于PAH組大鼠，血管管腔也無明顯狹窄。CON組和CIHH組大鼠肺組織和肺血管周圍無明顯

7、炎癥細胞浸潤；PAH組大鼠肺泡腔內(nèi)巨噬細胞明顯增多，肺小動脈周圍單核/巨噬細胞浸潤明顯增多，血管周圍炎癥評分明顯升高；而CIHH+MCT組大鼠肺泡腔內(nèi)、肺小動脈周圍單核/巨噬細胞明顯少于PAH組大鼠，血管周圍炎癥評分亦明顯偏低。與CON組大鼠相比較，PAH組大鼠肺動脈管壁厚度（MT％）顯著增加（P<0.01），管腔面積（VA%）明顯減?。≒<0.01）；CIHH+MCT組大鼠MT%較PAH組大鼠明顯降低（P<0.01）而VA%明顯升高（

8、P<0.01）。
　　結(jié)論：①CIHH預(yù)處理能有效預(yù)防MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的產(chǎn)生，改善右室肥厚程度及肺小動脈重構(gòu)；②CIHH預(yù)處理對 MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的預(yù)防作用可能與其抑制肺血管重構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　第二部分：慢性間歇性低壓低氧對野百合堿誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠肺動脈舒縮活動的影響。
　　目的：明確CIHH對MCT誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠肺動脈收縮和舒張的影響并探討其機制。
　　方法:大鼠隨機分為四組：正常對

9、照組（CON）、肺動脈高壓組（PAH）、間歇性低壓低氧處理組（CIHH）、間歇性低壓低氧預(yù)處理+肺動脈高壓組（CIHH+MCT）。CIHH組大鼠置于低壓低氧艙中，接受相當(dāng)于海拔5000 m高度、28天、每天6小時的低壓低氧處理，其余時間置于常氧環(huán)境。PAH組大鼠單劑量腹腔注射MCT（60 mg/kg）14天后造成PAH模型。CIHH+MCT組接受28天的CIHH處理后單劑量腹腔注射MCT（60 mg/kg），14天后進行實驗。每周定時測

10、量各組動物的體重和血壓。利用微血管環(huán)張力測定法分別觀察PE誘導(dǎo)的肺動脈環(huán)收縮、ACh誘導(dǎo)的肺動脈內(nèi)皮依賴性舒張和SNP誘導(dǎo)的肺動脈非內(nèi)皮依賴性舒張。采用Western blot和qPCR方法檢測肺動脈eNOS和CYP2J2表達的變化，探討CIHH對肺動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響；采用Western blot和qPCR方法檢測血管平滑機BKCa通道表達的變化，探討CIHH對肺動脈非內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響；采用免疫熒光方法檢測肺動脈ki-

11、67表達的變化，采用Western blot和qPCR方法檢測肺動脈ɑ-SM-actin表達的變化，觀察CIHH對肺動脈平滑肌細胞增殖和表型轉(zhuǎn)換的改變進而探討對其收縮功能的影響。
　　結(jié)果：⑴與CON組大鼠相比較，PAH組大鼠肺小動脈環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)降低（ P<0.05）， CIHH預(yù)處理可增加肺小動脈內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)（P<0.05），并預(yù)防大鼠肺小動脈內(nèi)皮依賴性舒張的降低（P<0.05）。⑵與CON組大鼠相比較，PAH組大

12、鼠肺小動脈環(huán)非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)降低（P<0.05），CIHH預(yù)處理可增加肺小動脈非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)（P<0.05），并預(yù)防大鼠肺小動脈非內(nèi)皮依賴性舒張的降低（P<0.05）。⑶與CON組大鼠相比較，PAH組大鼠肺小動脈環(huán)對PE反應(yīng)性降低、收縮減弱（P<0.05）；CIHH預(yù)處理可提高大鼠肺動脈對PE的收縮反應(yīng)，對抗PAH大鼠肺動脈對PE收縮的減弱反應(yīng)（P<0.05）。⑷與CON組大鼠相比較：PAH組大鼠肺小動脈eNOS和CYP2J2

13、表達下調(diào)（P<0.05），CIHH組大鼠eNOS和CYP2J2表達明顯上調(diào)（P<0.01），CIHH預(yù)處理（ CIHH+MCT組）可預(yù)防大鼠肺小動脈eNOS和CYP2J2下調(diào)（P<0.05）。⑸與CON組大鼠相比較：PAH組大鼠肺小動脈ɑ-SM-actin和BKCa通道表達下調(diào)（ P<0.05）， CIHH組大鼠ɑ-SM-actin和BKCa通道表達上調(diào)（P<0.05），CIHH預(yù)處理（CIHH+MCT組）可預(yù)防大鼠肺小動脈ɑ-SM-a

14、ctin和BKCa通道下調(diào)（P<0.05）。⑹與CON組大鼠相比較：PAH組大鼠肺小動脈ki-67表達上調(diào)（P<0.05），CIHH預(yù)處理（CIHH+MCT組）可預(yù)防大鼠肺小動脈ki-67上調(diào)（P<0.01）。
　　結(jié)論：①CIHH預(yù)處理對MCT誘導(dǎo)性大鼠肺動脈高壓的預(yù)防作用可能通過增強內(nèi)皮依賴性和非內(nèi)皮依賴性舒張、調(diào)節(jié)肺小動脈收縮所實現(xiàn)。②CIHH預(yù)處理可能通過上調(diào)大鼠肺小動脈eNOS和CYP2J2表達，增強肺小動脈環(huán)內(nèi)皮依賴性

15、舒張。③CIHH預(yù)處理可能通過上調(diào)大鼠肺小動脈血管平滑肌細胞BKCa通道表達，增強肺小動脈環(huán)非內(nèi)皮依賴性舒張。④CIHH預(yù)處理可上調(diào)ɑ-SM-actin表達，下調(diào)ki-67表達，從而可能通過抑制大鼠肺小動脈平滑肌細胞增殖和表型轉(zhuǎn)換、調(diào)節(jié)肺小動脈環(huán)收縮功能。
　　第三部分：慢性間歇性低壓低氧對野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓預(yù)防作用的免疫調(diào)節(jié)機制。
　　目的：探討CIHH對MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓預(yù)防作用的免疫調(diào)節(jié)機制。
　　

16、方法:大鼠隨機分為四組：正常對照組（CON）、肺動脈高壓組（PAH）、間歇性低壓低氧處理組（CIHH）、間歇性低壓低氧預(yù)處理+肺動脈高壓組（CIHH+MCT）。CIHH組大鼠置于低壓低氧艙中，接受相當(dāng)于海拔5000 m高度、28天、每天6小時的低壓低氧處理，其余時間置于常氧環(huán)境。PAH組大鼠單劑量腹腔注射MCT（60 mg/kg）14天后造成PAH模型。CIHH+MCT組接受28天的 CIHH處理后單劑量腹腔注射 MCT（60 mg/k

17、g），14天后進行實驗。每周定時測量各組動物的體重和血壓。采用ELISA和免疫組化方法檢測血清和肺組織 TNF-ɑ、IL-6表達的變化，采用流式細胞術(shù)測定外周血CD4+/CD8+T淋巴細胞比值以及脾臟CD3+T淋巴細胞凋亡率的變化；采用Western blot和qPCR方法從蛋白和基因水平檢測p-P38/p38MAPK、p-P65/IkBɑ表達的變化，探討CIHH對MCT誘導(dǎo)性大鼠肺動脈高壓預(yù)防作用的信號通路機制。
　　結(jié)果：⑴與

18、CON組大鼠相比較：PAH組大鼠外周血和肺組織TNF-ɑ、IL-6表達明顯上調(diào)（P<0.01），CIHH預(yù)處理（CIHH+MCT組）可預(yù)防大鼠MCT誘導(dǎo)性TNF-ɑ、IL-6表達上調(diào)（P<0.01）。⑵與CON組大鼠相比較：PAH組大鼠外周血CD4+T淋巴細胞水平明顯升高、CD8+T淋巴細胞水平明顯下降、CD4+/CD8+比值升高（P<0.05），脾臟CD3+T淋巴細胞凋亡率明顯下降（ P<0.01）；CIHH組大鼠外周血CD4+T淋巴

19、細胞水平下降、CD8+T淋巴細胞水平升高、CD4+/CD8+比值下降（P<0.01），脾臟CD3+T淋巴細胞凋亡率明顯升高（P<0.01）；CIHH預(yù)處理（CIHH+MCT組）可預(yù)防大鼠MCT誘導(dǎo)性CD4+升高、CD8+下降、CD4+/CD8+比值升高以及脾臟CD3+T淋巴細胞凋亡率下降（P<0.01）。⑶與CON組大鼠相比較：PAH組大鼠肺組織p-P38表達明顯上調(diào)、p38MAPK表達上調(diào)、p-P38/p38MAPK比值升高（P<0.

20、01）；CIHH組大鼠肺組織p-P38表達明顯下調(diào)、p38MAPK表達下調(diào)、p-P38/p38MAPK比值降低（P<0.01）；CIHH預(yù)處理（CIHH+MCT組）可預(yù)防大鼠MCT誘導(dǎo)性p-P38表達上調(diào)從而抑制p-P38/p38MAPK比值升高（P<0.01）。⑷與CON組大鼠相比較：PAH組大鼠肺組織P65表達明顯上調(diào)、IkBɑ表達明顯下調(diào)、P65/IkBɑ比值升高（P<0.01）；CIHH組大鼠血清P65表達明顯下調(diào)、IkBɑ表達

21、明顯上調(diào)、P65/IkBɑ比值降低（P<0.01）；CIHH預(yù)處理（CIHH+MCT組）可預(yù)防大鼠MCT誘導(dǎo)性P65表達上調(diào)、IkBɑ表達下調(diào)從而抑制P65/IkBɑ比值降低（P<0.01）。
　　結(jié)論：①CIHH預(yù)處理對MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓具有明顯的預(yù)防作用，此預(yù)防作用可能與其抑制肺小動脈重構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。②CIHH預(yù)處理可通過上調(diào)肺小動脈eNOS、CYP2J2及平滑肌細胞BKCa通道表達，增強肺小動脈內(nèi)皮依賴和內(nèi)皮非