1、福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文稻瘟病菌漆酶基因的生物信息學(xué)分析及其功能驗(yàn)證姓名：趙傳志申請學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：王宗華;魯國東20060401福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文摘 要漆酶( E C1 ．1 0 ．3 ．1 ) ，是一種能夠催化酚類物質(zhì)氧化還原反應(yīng)的含銅多酚氧化酶。漆酶具有很多重要的生物學(xué)作用，在高等植物上漆酶主要與降解木質(zhì)素有關(guān)，在真菌上漆酶的活性與色素的形成、子實(shí)體的形成、木質(zhì)素的降解、分生孢子的致病性和脫毒等作用有關(guān)

2、；漆酶因具有降解木質(zhì)素和使苯氧基類除草劑等有毒酚類物質(zhì)無毒化的作用，還可去除石油工業(yè)廢水的毒性，所以在造紙、飲料加工和環(huán)保等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究主要在生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上，對稻瘟菌的漆酶基因進(jìn)行了研究，并克隆了其中一個(gè)漆酶基因，做了過量表達(dá)分析。將G e n B a n k 中搜索到的模式生物粗糙脈孢菌N e u r o s p o r a c P a s s a 漆酶蛋白的氨基酸保守序列，提交到稻瘟菌全基因組數(shù)據(jù)庫中經(jīng)B l

3、a s t P ，找到了1 3 個(gè)與漆酶相關(guān)的蛋白，其中只有M G 0 9 1 3 9 ．4 相對應(yīng)的基因沒有內(nèi)含子，其它幾個(gè)基因含有卜6 個(gè)內(nèi)含子不等；進(jìn)一步分析1 3 個(gè)假設(shè)蛋白對應(yīng)的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)基因( M G 0 9 1 3 9 ．4 ，M G 0 7 7 7 1 ．4 ) 的E S T 在N C B I 上有相關(guān)的登陸；軟件S i g n a l P 3 ．0預(yù)測結(jié)果表明M G 0 7 7 7 1 ．4 幾乎不存在信號(hào)

4、肽的可能性，M G 0 9 1 3 9 ．4 是信號(hào)肽的可能性為9 5 ．5 ％，并且以9 9 ．6 ％的可能性在第1 8 和1 9 個(gè)氨基酸上剪切；T M H M M 跨膜蛋白預(yù)測結(jié)果顯示跨膜螺旋的氨基酸數(shù)為2 ．8 3 1 1 8 個(gè)，N 端在細(xì)胞質(zhì)膜上的可能性為0 ．1 3 3 3 9 ；軟件P r o t C o m pv 6 ．0 對M G 0 9 1 3 9 ．4 在細(xì)胞中的位最進(jìn)行預(yù)測的結(jié)果表明該蛋白是一個(gè)胞外分泌的蛋白；

5、軟件P r e d i c t P r o t e i n 對該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果。螺旋占1 0 ．3 8 5 ％，B 折疊占1 7 ．5 8 6 ％；漆酶蛋白的保守域( C D D )預(yù)測結(jié)果：保守區(qū)有1 1 6 個(gè)氨基酸，蛋白家族數(shù)據(jù)庫( P f a m ) 中的多銅氧化酶( g 衛(wèi)! l ￡蝕1 2 §§業(yè)) 的保守域相似性達(dá)到9 6 ．8 ％，與另一個(gè)多銅氧化酶( 趔! J ￡塑J ! 1 8 4

6、Q ) 的保守域的相似性達(dá)到8 8 ．9 ％；用D N A s t a r 分析此酶得出分子量6 5 9 8 0 ．7 8 道爾頓，等電點(diǎn)P I 為6 ．6 6 ，此酶含有5 9 7 個(gè)氨基酸，疏水氨基酸1 9 8 個(gè)，極性氨基酸1 9 1 個(gè)；通過與G e n B a n k 中其它生物的漆酶蛋白的氨基酸序列的比對，繪制出了系統(tǒng)進(jìn)化樹，預(yù)測了稻瘟病菌漆酶蛋白在漆酶進(jìn)化中的位置。本研究還以稻瘟病菌的測序菌株( 7 0 - 1 5 ) 為

7、材料，克隆了與蛋白M G 0 9 1 3 9 ．4相對應(yīng)的漆酶基因L a c z c z 。利用X h o l 和S p e I 位點(diǎn)將漆酶基因L a c z c z 正向插入到真核表達(dá)載體p T E l l 的強(qiáng)啟動(dòng)子R P 2 7 之下，構(gòu)建了過量表達(dá)載體p T E l l —L A C ，通過與稻瘟病菌原生質(zhì)體的共培養(yǎng)和兩次含潮霉素( 2 0 0 u g ／m 1 ) 的培養(yǎng)基的抗性篩選，獲得6 8 個(gè)突變體；提取基因組D N A