1、將已經分化的體細胞人工去分化生成多能性干細胞的方法稱為誘導多功能干細胞(iPSCs)方法。其誘導過程經歷了“體細胞的重編程”。應用胚胎干細胞(ESCs)的裂解提取液也可以介導分化終端的體細胞發(fā)生“體細胞重編程”的過程，逆轉化體細胞為多能干細胞，這種iPSCs方法稱為細胞誘導法。這項技術是利用ESCs裂解液中豐富的多種轉化因子直接誘導體細胞內與分裂增殖去分化相關基因的表達活性，在這個過程中既沒有ESCs基因組染色質的直接參與，也沒有使體細

2、胞基因組的序列發(fā)生結構性變化，而只是重新激活了被誘導體細胞內與干細胞性狀相關的基因，使其表達特性重新恢復到過去經歷過的干細胞階段，這是真正意義上的、比較“生理化”的、自然性逆分化過程。與其它iPSCs技術比較，細胞間的直接誘導技術，能夠提高體細胞逆分化、重編程的效率，所生成多能干細胞的安全性強，具有重要的價值和廣闊的應用前景。
　　 但是，這種體細胞重編程逆轉化體系中ESCs是直接參與者，被誘導的體細胞轉化生產多能干細胞以后，這

3、種被誘導產生的干細胞的現狀和多種內在的性狀都與誘導者相同或者相似，而且又是同時處于相同的生存環(huán)境中，在研究過程中要確定出現的多能干細胞的集落到底是來源于ESCs還是體細胞非常重要。因此，如何辨別多能干細胞來源是這個重編程體系的核心問題，直接關系到逆轉化的成功與否。本研究主要是利用與誘導體細胞不同性別來源的ESCs裂解提取液，建立小鼠ESCs體外誘導已分化體細胞為多能干細胞的異性來源鑒別體系，以解決體細胞重編程結果來源不明的問題，并在此基

4、礎上進一步探討ESCs裂解提取液介導的MEFs重編程逆轉化為多能干細胞的可能性及轉化效率。我們所建立的這種“異性來源鑒別體系”，方法簡單，鑒別結果可靠。首先，通過不同性別生殖嵴形態(tài)學差異鑒別出小鼠13.5天胚胎的性別，并分離培養(yǎng)出雌性MEFs;然后，利用PCR鑒定滋養(yǎng)層細胞的性別來分離培養(yǎng)出雄性ESCs;然后，在上述研究基礎上，使用雄性ESCs裂解提取液與雌性MEFs共孵育培養(yǎng)，誘導重編程體細胞為多能干細胞，通過檢測所得多能干細胞的性別

5、來確定其來源，建立小鼠ESCs體外誘導已分化體細胞為多能干細胞的異性來源鑒別體系，并且據此初步分析ESCs裂解提取液重編程體細胞的轉化率。研究結果如下:
　　 實驗一:不同性別MEFs的分離培養(yǎng)
　　 本研究利用妊娠13.5天雄性和雌性胎鼠的生殖嵴在形態(tài)學上存在明顯差異的特性，識別出不同性別昆明系小鼠胚胎，并分離培養(yǎng)出大量不同性別的MEFs，用于多能干細胞的異性來源鑒別體系研究。根據雄性小鼠特異性的Y染色體性別決定區(qū)（S

6、RY基因）的核心序列，設計一對引物，并對獲得的不同性別MEFs的DNA樣本進行PCR擴增，驗證不同性別胎鼠生殖嵴在形態(tài)學上存在的差異。結果表明PCR性別鑒定結果與MEFs來源胚胎的性別一致。不同性別的MEFs均具有典型的成纖維細胞特性，兩者在形態(tài)學上并沒有差異。因此，利用雄性與雌性胚胎在生殖嵴形態(tài)學上的差異可以快速分離獲得大量不同性別的MEFs，為多能干細胞的異性來源鑒別體系研究奠定基礎。
　　 實驗二:小鼠ESCs的分離培養(yǎng)與

7、性別鑒定
　　 本研究采集妊娠4天昆明小鼠的囊胚進行無飼養(yǎng)層培養(yǎng)。3-5天后，選取明顯隆起呈柱狀的內細胞團進行分離培養(yǎng)ESCs，同時分別對與分離ESCs的內細胞團來源一致的滋養(yǎng)層細胞進行PCR性別鑒定。通過形態(tài)學觀察、AKP染色、Oct-4和SSEA-1免疫細胞化學染色和EB三個胚層的標志基因RT-PCR檢測進行ESCs的鑒定。結果表明采集妊娠4天昆明小鼠的囊胚進行體外培養(yǎng)，通過滋養(yǎng)層細胞的PCR性別鑒定，可以成功分離培養(yǎng)出不同

8、性別的昆明小鼠ESCs，為多能干細胞的異性來源鑒別體系研究奠定基礎。
　　 實驗三:應用小鼠ESCs裂解液重編程體細胞為iPSCs的異性來源鑒別體系研究
　　 本研究利用液氮反復凍融7次的方法制備小鼠雄性ESCs提取液，用最終濃度為25U/100μ L的SLO滲透化作用經5-Aza-dC和TSA預處理雌性的MEFs，兩者共孵育培養(yǎng)1小時后，使用含有2mM CaCl2的ESCs培養(yǎng)液進行封膜處理，然后在培養(yǎng)皿中制備成細胞懸

9、液的培養(yǎng)液滴進行繼續(xù)培養(yǎng)，對得到的細胞集落通過形態(tài)學觀察、AKP染色、Oct-4免疫組化實驗和分析多能性標志基因的表達，鑒定重編程多能干細胞的性狀。最后，對得到的重編程多能干細胞，通過PCR性別鑒定的方法進行來源的可靠性鑒定。結果表明小鼠雄性ESCs提取液可以成功誘導雌性MEFs重編程逆轉化為多能干細胞，經性別鑒定證實所得到的多能干細胞確實來源于雌性MEFs，從而證實了應用小鼠ESCs體外誘導已分化體細胞為多能干細胞的異性來源鑒別體系的