1、抗體藥物是現(xiàn)代生物醫(yī)藥產業(yè)的主力軍，其臨床應用從最初的抗移植排斥逐步拓展至腫瘤、自身免疫疾病、抗感染、心腦血管疾病、眼科用藥以及生物安全防控等重大領域。治療性抗體的發(fā)展經歷了多克隆抗血清、鼠源單克隆抗體、人源化抗體以及全人抗體四個階段。人源化以及全人抗體是抗體藥物發(fā)展的主流和趨勢。在人-人雜交瘤技術、轉基因小鼠、抗體庫技術以及 EB病毒轉化人 B淋巴細胞等全人抗體制備技術中，抗體庫技術是目前最為常用的技術之一。
　　噬菌體抗體庫技

2、術是目前抗體研發(fā)最廣泛使用的技術。阿達木單抗（修美樂）是該技術平臺下篩選獲批的首個全人源單抗藥物，并且連續(xù)幾年（2012-2015）蟬聯(lián)全球暢銷藥物排行榜之首。但是，與目前抗體藥物規(guī)?；a常用的哺乳動物細胞表達體系相比，噬菌體使用的原核表達系統(tǒng)缺乏精細的蛋白質折疊和修飾過程，從中篩選獲得的抗體往往不能反映天然抗體的構象和翻譯后修飾水平。因此，利用哺乳動物細胞系統(tǒng)展示天然構象和翻譯后修飾的抗體具有實際的應用價值和前景。但是，受制于轉染效

3、率、培養(yǎng)體系等因素，哺乳動物細胞抗體庫往往庫容量較?。s106），限制了其廣泛應用。計算機輔助分子設計是近年來抗體優(yōu)化篩選的一個新興技術，利用計算機輔助分子設計針對特異性抗原表位設計人工抗體庫，能在一定程度上提高抗體庫中功能性抗體以及高親和力抗體的比例。因此，利用計算機輔助分子設計結合哺乳動物細胞展示系統(tǒng)有助于在有限的抗體庫容基礎上，優(yōu)化抗體庫質量，提高抗體庫篩選效率。
　　腫瘤免疫治療經歷了漫長的探索和重大的挫折之后逐漸顯現(xiàn)出良

4、好的治療效果并有望改變目前腫瘤的治療策略。針對CTLA-4、PD-1/PD-L1等“免疫卡控點分子”的單抗拮抗劑以及基于抗體結構設計的新型 CART技術在腫瘤免疫治療領域突破性的療效奠定了抗體在該領域的重要地位。程序性死亡受體-1（PD-1）是一類重要的免疫負性調控分子（也稱“免疫卡控點分子”），主要在激活的T細胞和B細胞中表達，通過與NK等細胞表面的PD-L1以及PD-L2配體結合，激活負調控信號，抑制免疫細胞的過度活化。大量的研究顯

5、示，多種腫瘤細胞表面高表達 PD-L1分子，通過 PD-1/PD-L1信號通路形成機體免疫耐受，逃避機體的免疫反應；特異性阻斷 PD-1/PD-L1信號通路，可以有效激活免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞。因此，PD-1/PD-L1成為腫瘤免疫治療的熱門靶標。國外制藥巨頭針對 PD-1分子單抗藥物研發(fā)展開了激烈的競爭，其中BMS公司研發(fā)的Nivolumab抗體獲FDA上市批準，應用于轉移性惡性黑色素瘤、鱗狀非小細胞肺癌、腎癌等多個腫瘤的臨床治療；除了

6、單藥使用外，Nivolumab與其他靶向藥物聯(lián)合使用的臨床試驗正在開展，并取得良好的進展。但是，目前國內只有兩家企業(yè)生產的PD-1抗體獲得臨床批文。因此，篩選具有自主知識產權的新型PD-1抗體具有重要的理論和實際意義。
　　本論文構建了哺乳動物細胞展示系統(tǒng)，并以PD-1為靶點，借助計算機輔助分子設計設計獲得了靶向PD-1抗體庫，結合流式高通量篩選候選抗體；進一步建立體內外評價模型，合理評價候選抗體生物學活性。
　　具體研究結

7、果如下：
　　1、哺乳動物細胞展示系統(tǒng)的構建及驗證
　　為了實現(xiàn)抗體在哺乳動物細胞表面展示、單一細胞表達單一抗體基因等抗體庫篩選的基本原則，我們在FRT-Flp-In定點整合系統(tǒng)的基礎上，構建了抗體Fab結構域膜表達載體PFRT/KIgG1FabHTM；同時構建了全長抗體表達載體PRT/KIgG1，可實現(xiàn)與抗體庫中篩選獲得候選抗體進行快速對接表達。流式細胞以及激光共聚焦等實驗顯示，PFRT/KIgG1FabHTM載體能夠實現(xiàn)

8、Fab抗體在哺乳動物細胞膜表面展示。抗埃博拉病毒抗體、抗西尼羅河病毒抗體、抗PD-1抗體以及抗CD3抗體等多個抗體的瞬時表達結果結果顯示，各抗體在全長抗體表達載體PRT/KIgG1上的瞬時表達量可達100μg/mL；利用該系統(tǒng)構建了抗PD-1抗體、抗CD3抗體等多個抗體穩(wěn)定表達細胞株，規(guī)模化流加培養(yǎng)14天后抗體的表達量可達1.2g/L。提示，PRT/KIgG1載體是一套通用、高效的全長抗體表達載體。進一步，我們利用紅、綠熒光蛋白驗證FR

9、T-Flp-In體系是否能實現(xiàn)單一細胞表達單一抗體基因。研究結果顯示，F(xiàn)RT-Flp-In穩(wěn)定轉染體系下，每個細胞均只表達一種熒光蛋白基因；表明FRT-Flp-In定點整合系統(tǒng)能夠實現(xiàn)單個細胞表達單一目的基因。借助構建的哺乳動物表面展示系統(tǒng)，將抗PD-1陽性抗體 MIL75的Fab結構域展示在 CHO表面，流式分析結果顯示， PD-1-FITC與細胞的結合呈劑量依賴性，提示該展示系統(tǒng)可以借助FACS實現(xiàn)高通量篩選。
　　2、靶向P

10、D-1抗體庫構建及篩選
　　利用分子模擬與對接搭建PD-1與PD-L1復合物空間結構，根據(jù)PD-L1與PD-1相互作用模式分析獲得 PD-L1參與識別 PD-1分子關鍵氨基酸殘基。進一步選用Nivolumab抗體輕、重鏈可變區(qū)歸屬亞組(IgKV3-11*01、IgHV3-33*01)所對應的通用序列為模板進行合成抗體庫的設計，在抗體模板可及性表面積較大的殘基位點上引入一些與PD-L1關鍵殘基理化性質相近的氨基酸突變，獲得與PD-L

11、1識別PD-1作用模式類似的靶向抗體庫。借助前期構建的哺乳動物細胞展示平臺，構建抗PD-1靶向抗體庫，轉化子計數(shù)和二代高通量測序結果顯示，抗體庫涵蓋了輕鏈及大部分重鏈理論序列（實測序列多樣性vs理論設計序列多樣性，輕鏈96/96;重鏈7321/8640）的多樣性。進一步利用流式分選技術對構建的細胞庫進行3輪富集篩選，獲得陽性克隆并進行測序獲得候選抗體序列。對候選抗體序列進行序列比對分析，按照序列同源性以及主鏈碳原子均方根位移等參數(shù)將所測

12、120個抗體序列分為10組，并從中篩選13個代表性序列。將13個代表性的抗體序列進行全長抗體表達，表達量結果提示13株抗體均具有較高表達水平（15.2μg/mL～74.5μg/mL）。其中FV63（59μg/mL）、FV78（74.5μg/mL）表達量明顯高于對照抗體MIL75（28.7μg/mL）。特異性結合活性實驗進一步篩選獲得5株親和力較好的抗體（1-4×10-10M）。借助生物信息學、結構生物學以及計算機輔助分子模擬技術對篩選獲

13、得的一系列抗體進行抗體空間結構穩(wěn)定能、識別PD-1分子空間表位等進行理論評估，最終確定了兩株的功能活性較好的候選抗體FV74、FV78。初步結果顯示FV78表達量優(yōu)于上市抗體MIL75。
　　3、靶向PD-1新抗體FV78生物學活性評價
　　進一步對靶向PD-1新抗體FV78開展體內、外功能評價。實驗結果顯示，F(xiàn)V78特異性識別人PD-1分子，并與CD28家族其它成員（CD28、CTLA4、BTLA、ICOS）不交叉；競爭E

14、LISA實驗結果提示FV78能夠有效阻斷PD-1與PDL1或PDL2之間相互作用，半數(shù)效應濃度均為9.9μg/mL。體外PBMC活化模型以及DC-CD4+T混合淋巴培養(yǎng)實驗模型中， FV78抗體能夠有效激活 T細胞釋放 IFN-γ。利用人外周血PBMC回輸免疫缺陷型小鼠 NPG，構建移植物抗宿主疾病模型（GVHD），合理評價抗PD-1抗體的免疫激活活性。結果顯示，給予FV78抗體可以有效激活免疫系統(tǒng)，加重GVHD反應，加速小鼠死亡(MS