1、骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stromal stem cells，BMSC)是一群存在于骨髓中的非造血干細胞，具有較強的自我更新能力和多向分化潛能。體外分離培養(yǎng)BMSC，在一定的誘導條件下，BMSC可以定向分化為成骨細胞，成骨細胞作為骨組織形成過程中的一種重要細胞，在骨缺損的修復過程中起關(guān)鍵作用，特別對構(gòu)建用于修復骨缺損的組織工程骨尤其重要。骨鈣素(osteocalcin，OCN)和堿性磷酸酶(alkaline phosph

2、atase，ALP)表達水平可作為成骨細胞鑒定和功能狀態(tài)評價的指標。 骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein，BSP)是一種細胞基質(zhì)中的非膠質(zhì)蛋白質(zhì)，BSP在骨發(fā)生時可啟動礦化晶體的生長，能夠介導成骨細胞與骨礦物質(zhì)的結(jié)合，與骨的分化、組織形成和再塑有關(guān)；同時BSP具有良好的成骨效應。因此，研究BSP對BMSC向成骨細胞分化的影響及其作用機制，有可能為組織工程骨在臨床的推廣應用提供技術(shù)基礎(chǔ)。本課題用改良的骨髓培養(yǎng)法體

3、外分離、擴增培養(yǎng)BMSC；定向誘導其向成骨細胞分化，進行成骨鑒定。通過添加rhBSP和真核表達質(zhì)粒pEGFPCI-mBSP轉(zhuǎn)染BMSC，初步研究。BSP對BMSC成骨分化的影響。主要研究結(jié)果如下： 1．通過改良的骨髓培養(yǎng)法原代培養(yǎng)BMSC，不但提高了BMSC的分離率和增殖能力，而且使分離時間縮短、污染機會減少、工作效率提高。 2．分離培養(yǎng)的大鼠、小鼠BMSC均呈纖維狀，梭形，有突起，約7～9d時，細胞匯合成片，其融

4、合率可達到80％；消化傳代后的細胞較原代細胞體積大，呈不規(guī)則的多角形，有短而薄的胞質(zhì)突起，且貼壁較快，12h后貼壁率可達80％以上；小鼠BMSC超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出早期細胞的特點。不同密度接種小鼠BMSC結(jié)果顯示，最佳接種密度為1×10<'4>～6×10<'4>個/mL。小鼠BMSC傳代后細胞第1～3d處于潛伏適應期；第4～8d進入對數(shù)生長期；而后增殖相對緩慢開始進入生長平臺期。細胞周期檢測顯示，100％細胞都是二倍體，88％以上的細胞處于靜

5、止期細胞，僅少數(shù)細胞處于增殖活躍期。STRO-1免疫組化和免疫熒光細胞檢測結(jié)果顯示，所分離培養(yǎng)的小鼠、人BMSC胞漿中表達STRO-1。 3．定向誘導小鼠BMSC、大鼠BMSC向成骨細胞分化，10d～12d時細胞間出現(xiàn)了較多散在的致密圓形礦化結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)周圍的細胞密度較高，輪廓不清，結(jié)節(jié)中心透光性差，符合成骨細胞的形態(tài)學特征。成骨誘導2周的第1代小鼠BMSC的細胞周期結(jié)果顯示，100％細胞都是二倍體，其中S+G<,2>期細胞

6、約占11.72％，而處于G<,l>期的細胞約占87.28％，即誘導的細胞大部分處于分裂前的靜止期。成骨誘導2周的大鼠BMSC的OCN表達呈明顯陽性。小鼠和大鼠BMSC經(jīng)成骨誘導2周后，ALP染色為陽性，并隨培養(yǎng)時間延長逐漸增強；同時細胞呈復層生長，出現(xiàn)Von kossa染色陽性的礦化結(jié)節(jié)，提示礦化基質(zhì)沉積。 4．小鼠BMSC中添加rhBSP的最佳濃度為10<'-10>mol/L～10<'-11>mol/L，對BMSC的生長起一定

7、的促進作用，但是隨著成骨誘導時間的延長，成骨誘導劑促進BMSC的成骨分化，而相對抑制其增殖。小鼠BMSC經(jīng)含rhBSP的成骨誘導液連續(xù)誘導培養(yǎng)2周后，細胞呈復層生長，并出現(xiàn)不透明結(jié)節(jié)；Von Kossa染色可見礦化結(jié)節(jié)顆粒變大，數(shù)量增多，礦化基質(zhì)沉積明顯，初步提示rhBSP具備促進組織礦化、成骨細胞與礦化基質(zhì)結(jié)合的功能，表明rhBSP具有良好的成骨誘導性。真核表達質(zhì)粒pEGFPCI-mBSP通過脂質(zhì)體介導的方式轉(zhuǎn)染小鼠BMSC，轉(zhuǎn)染36