1、研究背景
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞重要的細(xì)胞器，在蛋白質(zhì)的折疊、質(zhì)量控制、維持鈣穩(wěn)態(tài)等方面都極其重要，直接參與并影響細(xì)胞的各種生命活動(dòng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的各種定位蛋白，如分子伴侶、酶等通過(guò)對(duì)新合成的蛋白肽鏈進(jìn)行加工、折疊修飾，幫助蛋白質(zhì)形成特定的空間構(gòu)象并定向轉(zhuǎn)運(yùn)。Ca2+結(jié)合蛋白、二硫鍵異構(gòu)酶等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白不僅可以發(fā)揮分子伴侶作用，還可定位于細(xì)胞胞液、細(xì)胞外，參與細(xì)胞的增殖、遷移及惡性疾病如腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　Reticulocalbi

2、n1(RCN1)具有鈣離子結(jié)合蛋白的特點(diǎn)，是CREC家族成員之一。人源RCN1蛋白由位于染色體11p13的RCN1基因編碼，全長(zhǎng)331個(gè)氨基酸殘基，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是:N端是一段信號(hào)肽，由29個(gè)氨基酸殘基組成;中間區(qū)域包含6個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域;在羧基末端是一段內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號(hào)HDEL。
　　RCN1的定位與分布:RCN1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白，但也發(fā)現(xiàn)RCN1可定位于骨內(nèi)皮細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞的表面，但機(jī)制不詳;而且RCN1的C端的HDEL與

3、典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)KDEL有別，因此，RCN1也可分泌至胞外。RCN1主要分布于分泌器官，不同器官的組成細(xì)胞中RCN1的表達(dá)高低不同。
　　RCN1的功能:RCN1功能研究不多。研究顯示，鼠源RCN1基因的純合缺失可導(dǎo)致胚胎致死;另外，分泌的RCN1可作為配體，介導(dǎo)凋亡的神經(jīng)細(xì)胞被吞噬。RCN1的表達(dá)異常與疾病、特別是腫瘤的關(guān)系引起關(guān)注，RCN1在高侵襲性的乳腺癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞中均呈高表達(dá)。而在前列腺癌中

4、，RCN1在侵襲力較高的細(xì)胞中呈低表達(dá)。基于RCN1功能不詳，相關(guān)研究初露端倪，尚需詳盡探討。本論文首先從臨床樣本、數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其表達(dá)進(jìn)行分析，并通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步探討了RCN1在前列腺癌中的作用。
　　研究結(jié)果
　　第一部分 RCN1在前列腺癌組織中高表達(dá)
　　1.RCN1在前列腺癌組織中高表達(dá)
　　根據(jù)腫瘤基因數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA，oncomine已有的數(shù)據(jù)分析前列腺癌中RCN1的mRNA水平高，但是生存分析卻顯示

5、高水平的mRNA與病人的生存率無(wú)顯著相關(guān)性。本論文分別收集了前列腺癌組織樣本11例，良性前列腺增生組織樣本15例，利用免疫組化檢測(cè)RCN1在癌組織和增生組織中的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中RCN1顯著高表達(dá)。為了確定RCN1是否與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)，利用免疫組化檢測(cè)周期蛋白Cyclin D1，臨床樣本檢測(cè)結(jié)果顯示，Cyclin D1不僅在前列腺癌組織中低表達(dá)，在良性增生組織中也呈現(xiàn)低表達(dá)，且與RCN1的表達(dá)無(wú)相關(guān)性。
　　

6、2.RCN1表達(dá)與細(xì)胞增殖無(wú)相關(guān)性
　　細(xì)胞水平的檢測(cè)結(jié)果顯示，RCN1的表達(dá)水平在激素非依賴、侵襲性較強(qiáng)的PC3細(xì)胞中RCN1的表達(dá)最低，低于RWPE1，即前列腺正常上皮細(xì)胞。前列腺癌LNCaP細(xì)胞中RCN1表達(dá)最高，DU145細(xì)胞中RCN1表達(dá)介于PC3和LNCaP細(xì)胞之間。因此，選用RCN1低表達(dá)的PC3過(guò)表達(dá)RCN1，細(xì)胞增殖結(jié)果卻顯示過(guò)表達(dá)RCN1對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響。因此，RCN1可能與細(xì)胞增殖無(wú)關(guān)。
　　第二部

7、分下調(diào)RCN1的表達(dá)可促進(jìn)不同前列腺癌細(xì)胞凋亡或壞死性凋亡
　　DU145和LNCaP細(xì)胞RCN1表達(dá)高，我們利用流式細(xì)胞術(shù)分析降低RCN1表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞存活的影響。
　　1.下調(diào)RCN1阻滯DU145細(xì)胞于S期
　　下調(diào)RCN1可影響細(xì)胞周期。下調(diào)DU145細(xì)胞中的RCN1，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯于S期。下調(diào)LNCaP細(xì)胞中的RCN1可使周期阻滯在G2/M期。檢測(cè)S期和G2/M期關(guān)鍵調(diào)控蛋白Cyclin B在前列腺癌

8、組織和良性增生組織的表達(dá)，結(jié)果顯示，前列腺癌組織中Cyclin B顯著高表達(dá)，且與RCN1具有一定正相關(guān)性。
　　2.下調(diào)RCN1誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡
　　DU145細(xì)胞中下調(diào)RCN1可以抑制細(xì)胞活力，引起細(xì)胞死亡。下調(diào)RCN1后DU145細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯，Caspase-3酶活性升高，WB結(jié)果顯示PARP剪切帶明顯。Z-VAD-FMK是Caspase抑制劑，在下調(diào)RCN1后加入，可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，將DU1

9、45細(xì)胞注入裸鼠皮下成瘤，瘤內(nèi)注射siRCN1。結(jié)果顯示，瘤內(nèi)注射siRCN1后腫瘤重量和體積顯著低于NC組。結(jié)果證明，瘤內(nèi)注射siRCN1可以下調(diào)瘤內(nèi)細(xì)胞RCN1的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。所以，下調(diào)RCN1使DU145發(fā)生細(xì)胞凋亡。
　　3.下調(diào)RCN1促進(jìn)LNCaP細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡
　　下調(diào)RCN1可引起LNCaP細(xì)胞死亡。下調(diào)RCN1后，LNCaP細(xì)胞壞死明顯。但是，Caspase-3無(wú)明顯變化，同時(shí)其底物PARP剪

10、切無(wú)差異，Z-VAD-FMK不能逆轉(zhuǎn)下調(diào)RCN1造成的LNCaP死亡。然而，Necrostatin-1，壞死性凋亡抑制劑，可以部分逆轉(zhuǎn)LNCaP死亡。這說(shuō)明下調(diào)RCN1能引起LNCaP細(xì)胞壞死性凋亡。
　　第三部分下調(diào)RCN1引起DU145和LNCaP凋亡和壞死性凋亡的機(jī)制研究
　　1.RCN1下調(diào)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡
　　(1)下調(diào)RCN1誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　下調(diào)RCN1可增強(qiáng)分子伴侶GRP7

11、8活性，同時(shí)PERK活性增強(qiáng)，elF2α活性降低，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生。下調(diào)RCN1可使DU145細(xì)胞CHOP被激活，誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生。另外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA可逆轉(zhuǎn)下調(diào)RCN1造成的DU145和LNCaP細(xì)胞死亡，說(shuō)明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了RCN1下調(diào)引起的DU145細(xì)胞凋亡和LNCaP細(xì)胞的壞死性凋亡。
　　(2) Ca2+釋放誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡
　　下調(diào)RCN1后，CaMKⅡ被激活，說(shuō)明胞液中的Ca2+增加。加入內(nèi)質(zhì)

12、網(wǎng)鈣庫(kù)釋放通道受體蛋白IP3R的抑制劑Xestospongin C，可以部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞死亡。而蘭尼堿受體RyR抑制劑Ryanodine對(duì)下調(diào)RCN1造成的細(xì)胞死亡卻無(wú)明顯逆轉(zhuǎn)作用。說(shuō)明下調(diào)RCN1導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+通過(guò)IP3R通道釋放到胞液中，Ca2+信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡發(fā)生。
　　2.PTEN參與下調(diào)RCN1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
　　(1) PTEN參與下調(diào)RCN1誘導(dǎo)的DU145細(xì)胞凋亡
　　通過(guò)前期

13、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)初步推測(cè)，RCN1可能更多的參與維持細(xì)胞存活，而不是促進(jìn)細(xì)胞增殖。結(jié)果證實(shí)，下調(diào)DU145細(xì)胞中的RCN1可降低AKT活性，LNCaP細(xì)胞無(wú)變化。這說(shuō)明AKT通路參與了RCN1下調(diào)誘導(dǎo)的DU145細(xì)胞的凋亡。通過(guò)遺傳學(xué)背景分析，DU145是PTEN野生型前列腺癌細(xì)胞，在DU145細(xì)胞中，下調(diào)RCN1可使PTEN活性升高，AKT活性降低。而同時(shí)下調(diào)RCN1和PTEN，DU145細(xì)胞凋亡緩解，AKT活性水平升高，說(shuō)明下調(diào)RCN1影響

14、細(xì)胞的存活是通過(guò)PTEN/AKT通路。
　　(2) AR和TP53可能參與下調(diào)RCN1誘導(dǎo)的LNCaP細(xì)胞壞死性凋亡
　　雄激素依賴的LNCaP癌細(xì)胞，其增殖很大程度上依賴于雄激素/雄激素受體(AR)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，下調(diào)AR，RCN1略有變化，說(shuō)明其可能參與介導(dǎo)RCN1下調(diào)引起的LNCaP死亡。LNCaP中TP53可以發(fā)揮正常功能，下調(diào)RCN1，TP53表達(dá)略有降低，說(shuō)明AR和TP53可能參與了下調(diào)RCN1誘導(dǎo)的LNCaP

15、細(xì)胞壞死性凋亡過(guò)程。
　　結(jié)論:
　　1.前列腺癌組織中RCN1顯著高表達(dá)，但與病人生存率無(wú)相關(guān)性。周期蛋白Cyclin D1表達(dá)水平較低，與RCN1無(wú)顯著相關(guān)性。過(guò)表達(dá)RCN1對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響。
　　2.下調(diào)RCN1后，DU145阻滯于S期，誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡。DU145裸鼠實(shí)驗(yàn)同樣表明，在體內(nèi)干擾RCN1也可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　3.下調(diào)RCN1可引起前列腺癌LNCaP細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞壞死性凋亡。

16、　　4.下調(diào)RCN1引起的細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡均依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及Ca2+釋放。但不同的是，下調(diào)RCN1激活了DU145細(xì)胞內(nèi)的PTEN，抑制AKT活性，細(xì)胞凋亡產(chǎn)生。而AR和TP53可能參與了下調(diào)RCN1引起的LNCaP細(xì)胞的壞死性凋亡。
　　創(chuàng)新點(diǎn)與不足之處
　　1.創(chuàng)新點(diǎn)
　　(1)首次報(bào)道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白R(shí)eticulocalbin-1(RCN1)在前列腺癌組織中高表達(dá)，并通過(guò)腫瘤基因數(shù)據(jù)庫(kù)分析RCN1表達(dá)水平與病

17、人生存率無(wú)顯著相關(guān)性。
　　(2)首次報(bào)道RCN1可能參與調(diào)控細(xì)胞周期，但對(duì)TP53野生的LNCaP細(xì)胞作用并不顯著;且與促進(jìn)細(xì)胞增殖相比，RCN1可能更多的參與維持細(xì)胞存活。
　　(3)首次報(bào)道RCN1下調(diào)可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、CaMKⅡ的活化、PTEN活化、抑制AKT活性參與DU145細(xì)胞凋亡。對(duì)TP53野生的LNCaP細(xì)胞，下調(diào)RCN1可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、CaMKⅡ的活化調(diào)控誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞壞死性凋亡。
　　2.不足