1、糞腸球菌是重要的機(jī)會(huì)性致病菌，本試驗(yàn)對(duì)糞腸球菌TLME3株毒力因子sprE基因進(jìn)行原核表達(dá)，并應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析sprE基因，預(yù)測(cè)其B細(xì)胞抗原表位，為下一步構(gòu)建基因疫苗做準(zhǔn)備。
　　根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中查找的登錄號(hào)為DQ985697.1的糞腸球菌絲氨酸蛋白酶基因的堿基序列，用Primer5和Olige6設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，對(duì)目的基因進(jìn)行克隆和原核表達(dá)，使用的克隆和原核表達(dá)載體分別為pMD18TM-T Vector

2、和pET-28a(+)。以糞腸球菌TLME3株總DNA為擴(kuò)增模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-T-sprE，用E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。通過(guò)藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)篩選陽(yáng)性菌株，應(yīng)用PCR及單、雙酶切進(jìn)行鑒定，鑒定無(wú)誤后送往公司測(cè)序。測(cè)序后進(jìn)行原核表達(dá)，構(gòu)建pET-28a-sprE重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中;對(duì)pET-28a-sprE/BL21菌株進(jìn)行陽(yáng)性篩選，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)絲氨酸蛋白酶蛋白，經(jīng)SDS-PA

3、GE蛋白電泳進(jìn)行鑒定。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)表達(dá)的絲氨酸蛋白酶蛋白序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，運(yùn)用B細(xì)胞線性表位的預(yù)測(cè)方法-萬(wàn)氏法預(yù)測(cè)潛在抗原表位。
　　本試驗(yàn)成功克隆了糞腸球菌TLME3株毒力因子sprE基因，其堿基序列長(zhǎng)855bp，編碼285個(gè)氨基酸。pET-28a-sprE/BL21表達(dá)載體構(gòu)建成功，用SDS-PAGE方法鑒定IPTG誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)，絲氨酸蛋、白酶蛋白為32KD，與預(yù)期一致。成功預(yù)測(cè)了糞腸球菌TLME3株絲氨酸