1、研究背景與目的：
　　黑色素瘤是死亡率最高的皮膚病，惡性程度極高，在病程早期就可轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是決定該疾病患者生存率和預(yù)后的關(guān)鍵因素之一，也是當(dāng)前治療中的難題。因此，抑制其轉(zhuǎn)移是提高生存率的關(guān)鍵。
　　高強(qiáng)度聚焦超聲消融或輻照（High intensity focused ultrasound， HIFU消融或輻照）是一種無創(chuàng)性的腫瘤熱消融治療手段，該技術(shù)從1990年開始在我國興起。其原理是將體外低能量的超聲聚集于體內(nèi)待治療的組

2、織，利用超聲波的特性，在靶點(diǎn)內(nèi)產(chǎn)生瞬間高溫等效應(yīng)實(shí)現(xiàn)精確地靶區(qū)內(nèi)細(xì)胞的消融，而不影響周圍組織。目前HIFU消融廣泛應(yīng)用在子宮肌瘤、乳腺癌等多種良惡性實(shí)體瘤的臨床治療中，而且療效顯著。但對(duì)于HIFU應(yīng)用在黑色素瘤治療及其機(jī)制方面的研究較少。
　　microRNAs(miRNAs)是一類體內(nèi)非編碼小RNA，長度約為18~25個(gè)核苷酸，其在轉(zhuǎn)錄后水平來參與調(diào)控各個(gè)靶基因表達(dá)，從而參與調(diào)節(jié)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)。近幾年，有研究顯示

3、miRNAs與腫瘤物理治療相關(guān)，例如：輻射耐受性、放射離子所誘導(dǎo)殘留細(xì)胞的凋亡等生物效應(yīng)。在為了改善放療效果的治療策略中，miRNAs是很有前景的新靶點(diǎn)，尤其microRNA-21（miRNA-21）。HIFU作為一種新型的物理治療腫瘤的方法，對(duì)于其機(jī)制的研究，主要關(guān)注物理效應(yīng)（熱凝固效應(yīng)和空化效應(yīng)），較少關(guān)注miRNAs等生物分子是否參與其中。
　　HIFU消融對(duì)腫瘤原發(fā)灶的治療作用已毋庸置疑，但在臨床實(shí)際消融過程中，因?yàn)樵O(shè)備、

4、影像、人員操作等技術(shù)原因和腫瘤部位、腫瘤大小等病灶本身的因素，想要完全將腫瘤病灶消融有相當(dāng)難度，因此臨床實(shí)際消融中不可避免的會(huì)有腫瘤細(xì)胞殘留，而它們的生物學(xué)行為則是在消融原發(fā)灶之后決定療效和預(yù)后的關(guān)鍵要素。有研究表明射頻消融在治療肝癌時(shí)會(huì)加速殘留肝癌細(xì)胞的增殖。那么，HIFU消融后殘留的腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡能力、尤其是對(duì)患者預(yù)后起決定性作用的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力會(huì)怎樣變化呢？這些問題的答案對(duì)于HIFU消融是否適用于臨床黑色素瘤的治療至關(guān)重要。<

5、br>　　基于上述，本研究擬在體內(nèi)外探討HIFU處理后殘留黑色素瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的變化，并重點(diǎn)關(guān)注對(duì)黑色素瘤患者的預(yù)后起關(guān)鍵作用的殘瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的變化及其潛在機(jī)制。旨在為HIFU消融應(yīng)用于黑色素瘤的臨床治療提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.HIFU消融對(duì)殘留的小鼠黑色素瘤生長、轉(zhuǎn)移的影響：
　　1）構(gòu)建小鼠皮下黑色素瘤模型，進(jìn)行HIFU消融，記錄消融后皮下瘤體的體積變化，TUNEL試驗(yàn)檢測(cè)殘留細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)。

6、>　　2)通過記錄皮下黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率和計(jì)數(shù)肺部轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目來反應(yīng)殘留細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力；通過qPCR檢測(cè)小鼠血循環(huán)中黑色素瘤細(xì)胞的數(shù)量，以反映HIFU消融后殘留腫瘤細(xì)胞由原發(fā)部位脫落入血的能力；同時(shí)，在輻照后第14天尾靜脈注射同種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行再刺激，觀察 HIFU輻照對(duì)同種腫瘤細(xì)胞在肺部定植能力的影響。再通過western blot和免疫組織化學(xué)染色探討轉(zhuǎn)移相關(guān)分子 E-cadherin、Vimentin、VEGF和 MMP9在殘留

7、組織中表達(dá)的變化，以探討 HIFU影響殘留腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。
　　2.在體外HIFU輻照小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10，輻照時(shí)間為1s、2s、3s，輻照后將細(xì)胞放在培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)12h后去除不貼壁的細(xì)胞，將有貼壁能力的細(xì)胞作為殘留細(xì)胞，分別采用臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)、MTT試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕試驗(yàn)和 transwell試驗(yàn)來檢測(cè)其存活、增殖、凋亡和遷移行為的改變，并與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較。
　　3.HIFU輻照抑制殘留黑色素瘤

8、細(xì)胞遷移能力及減少肺轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制探討：
　　1）通過qPCR、western blot和免疫組織化學(xué)驗(yàn)證miRNA-21及其潛在靶基因PTEN在HIFU處理的腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)的變化，以及其下游AKT信號(hào)通路的活化程度。
　　2）經(jīng)過熒光素酶活性分析和 western blot驗(yàn)證 B16-F10細(xì)胞中miRNA-21對(duì)PTEN表達(dá)的靶向調(diào)控作用。
　　3）用劃痕試驗(yàn)和transwell試驗(yàn)驗(yàn)證miRNA-21和P

9、TEN在HIFU輻照抑制殘留B16-F10細(xì)胞遷移中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.HIFU消融延長小鼠存活時(shí)間，抑制殘留黑色素瘤的生長，減少黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移。
　　1）與對(duì)照組比，HIFU消融組小鼠生存期延長（P<0.0001）。兩組小鼠皮下瘤體積在 HIFU處理后即刻并無明顯差異，但從HIFU后第20天開始出現(xiàn)顯著差異，HIFU組瘤體體積小于假照組（P<0.05，n=15）；TUNEL試驗(yàn)顯示HIFU后14天的殘余組

10、織中正處于凋亡期的細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組（P<0.01）。
　　2）肉眼觀察時(shí)，對(duì)照組肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率為20％(3/15)，且每只小鼠的肺上有黑色轉(zhuǎn)移灶為1.67±0.58個(gè)；HIFU組15只小鼠中肉眼觀察時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)有肺部轉(zhuǎn)移，僅有的一例轉(zhuǎn)移灶是在組織切片、H-E染色后在顯微鏡下才能發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移灶，故HIFU組轉(zhuǎn)移率為6.7%(1/15)。
　　3）qPCR結(jié)果顯示 HIFU組在消融后第7天血中的 MAGE-A3、MART-1和 P

11、AX3的表達(dá)量分別為0.578±0.482，0.822±0.309，0.794±0.356；對(duì)照組分別為3.183±0.323，1.416±1.374，1.654±1.290。兩組的三個(gè)指標(biāo)的差異都有顯著性（P<0.05）；在HIFU消融后第14天，其 MAGE-A3的表達(dá)量為0.882±0.514，仍然顯著低于對(duì)照組（4.852±2.583，P<0.05）。提示：HIFU輻照減少血液循環(huán)中的黑色素瘤細(xì)胞。
　　4）在HIFU消融

12、后第14天，尾靜脈注射B16-F10細(xì)胞，HIFU組肺部形成的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)為26.4±6.6/鼠，對(duì)照組為45.8±7.6/鼠（P<0.05， n=10）。提示HIFU輻照可降低腫瘤細(xì)胞在肺部的定植能力。
　　5）經(jīng)過western blot和免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，HIFU組上皮細(xì)胞的標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)升高(P<0.05)，間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物Vimentin表達(dá)有降低趨勢(shì)(P>0.05)；同時(shí)，VEGF和MMP9表達(dá)明顯低

13、于對(duì)照組(P<0.05)。提示HIFU輻照可以部分逆轉(zhuǎn)EMT、抑制VEGF和MMP9的表達(dá)。
　　2. HIFU輻照1s、2s和3s后的B16-F10細(xì)胞的存活率、增殖能力、凋亡細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比均無明顯差異（P>0.05），但48h的劃痕愈合率則明顯低于對(duì)照組(P<0.001)，穿膜細(xì)胞數(shù)也顯著低于對(duì)照組(P1s<0.05, P2s<0.001, P3s<0.001)。提示HIFU輻照抑制殘留B16-F10細(xì)胞的遷移能力。

14、>　　3.HIFU輻照通過減少miRNA-21表達(dá)從而上調(diào)其靶基因PTEN，進(jìn)而抑制殘留的小鼠黑色素瘤細(xì)胞的遷移。
　　1)在殘留腫瘤組織和殘留細(xì)胞中：qPCR顯示，miRNA-21明顯低于假照組（P<0.001,P<0.05）；western blot顯示其潛在靶基因PTEN的表達(dá)升高（ P<0.05,P<0.05），其下游的 AKT信號(hào)通路的活化形式p-Akt(T308)/t-Akt和 p-Akt(S473)/t-Akt的相對(duì)

15、表達(dá)量則明顯降低（P<0.05, P<0.05）。提示：HIFU處理下調(diào)miRNA-21，從而上調(diào)其潛在靶基因PTEN，進(jìn)而抑制其下游Akt通路的活化。
　　2)熒光素酶活性分析顯示，在加入 miRNA-21 mimic和預(yù)測(cè)的PTEN-3’UTR中與miRNA-21互補(bǔ)的序列后，報(bào)告基因熒光素酶的活性下降，以1號(hào)互補(bǔ)序列特別顯著（P<0.05），而加入miRNA-21的陰性對(duì)照序列或突變型PTEN-3’非編碼互補(bǔ)序列后熒光素酶的

16、活性沒有顯著變化。證明在B16-F10細(xì)胞中miRNA-21直接靶向PTEN。3)加入anti-miRNA-21并HIFU輻照后，殘留細(xì)胞的劃痕愈合率明顯降低（P<0.01），穿膜細(xì)胞數(shù)也有明顯減少（P<0.01）；但，在加入anti-miRNA-21后再加入psiPTEN以敲低PTEN的表達(dá)后，殘留細(xì)胞的劃痕愈合率和穿膜細(xì)胞數(shù)又部分恢復(fù)（P<0.01）。提示：HIFU輻照通過下調(diào)miRNA-21從而升高PTEN的表達(dá)來抑制殘留黑色素瘤

17、細(xì)胞在體外的遷移能力。
　　結(jié)論：
　　1.HIFU消融延長小鼠的存活時(shí)間，對(duì)殘留小鼠皮下黑色素瘤有抑制生長、促進(jìn)凋亡的作用。
　　2.HIFU輻照抑制殘留小鼠黑色素瘤細(xì)胞在體外的遷移及在體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移。
　　3. HIFU消融減少原發(fā)部位的腫瘤細(xì)胞入血，其機(jī)制可能與其部分逆轉(zhuǎn)殘留細(xì)胞的EMT有關(guān)；同時(shí)，HIFU消融還抑制血循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞在肺部的定植。
　　4.HIFU通過下調(diào)miRNA-21從而上調(diào)其靶基