1、捻轉血矛線蟲(Haemonchus contortus)是牛、羊等反芻動物的主要寄生性線蟲,寄生于動物皺胃粘膜的表面,引起捻轉血矛線蟲病,導致動物出現(xiàn)貧血、消瘦,甚至引起死亡。使用抗蠕蟲藥物是目前防治該病的主要措施,但線蟲耐藥性的日益嚴重迫切需要發(fā)展新的防治策略,疫苗作為一種新的有效的防治策略,具有廣闊的應用前景。由于線蟲具有復雜的生活史,抗原成分繁多,到現(xiàn)在為止,還沒有一種線蟲疫苗應用于生產。氨肽酶H11是捻轉血矛線蟲L4幼蟲和成蟲階

2、段表達的一種整合膜蛋白,被認為是目前為止免疫效果最好的一種候選抗原(減卵率＞90％,減蟲率＞75％),而利用大腸桿菌和昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達的重組形式均不能引起有效的免疫保護。秀麗隱桿線蟲因其與寄生性線蟲在進化上的近緣性,被認為是研究寄生性線蟲基因功能和表達寄生性線蟲疫苗候選抗原的理想系統(tǒng)。本研究的主要目的是:探明捻轉血矛線蟲疫苗候選抗原基因H11的基因組結構特征；同時以秀麗隱桿線蟲為模式,建立研究寄生性線蟲基因功能和表達寄生性線蟲疫苗候

3、選抗原的轉基因技術體系；在此基礎上分析H11基因5’側翼區(qū)序列的啟動子轉錄活性,研究利用建立的轉基因技術體系,表達H11基因的可行性,為寄生性線蟲的疫苗研制提供新方法。1.捻轉血矛線蟲疫苗候選抗原基因H11的基因組結構分析
　　 參照已發(fā)表的捻轉血矛線蟲疫苗候選抗原H11的基因序列,以捻轉血矛線蟲ZJ株的總RNA為模板,進行RT-PCR擴增,成功擴增出H11基因。對H11及其同源類似物進行比對分析,發(fā)現(xiàn)H11含有一個鋅指結合基序

4、HEXXHXW,具有典型的微粒體氨肽酶結構域特征。通過在功能域保守區(qū)域設計特異性引物,利用長距離PCR技術和基因步移技術,成功獲得了H11的基因組序列。結果表明,H11的ORF大小為2919 bp,編碼972個氨基酸；獲得的H11基因組大小為14959 bp,擁有25個外顯子和24個內含子,內含子和外顯子之間具有典型的GT……AG結構。捻轉血矛線蟲H11基因組序列的獲得為我們進一步開展H11的相關研究提供了重要素材。2.以秀麗隱桿線蟲為

5、模式,建立研究寄生性線蟲基因功能和表達寄生性線蟲疫苗候選抗原的轉基因技術體系
　　 為建立秀麗隱桿線蟲的轉基因技術體系,利用PCR技術從秀麗隱桿線蟲基因組DNA中擴增獲得Act-1基因的核心啟動子序列、T07F10.1A基因的核心啟動子序列與3’UTR的Poly(A)信號序列,以及從表達載體pEGFP-N1上擴增獲得SV40早期mRNA的Poly(A)信號序列與EGFP基因。以pBluescript SK+或pEGFP-4.1為

6、基本載體骨架,分別構建由Act-1基因的核心啟動子序列、T07F10.1A基因的核心啟動子序列調控,EGFP作為報告基因的重組表達載體。通過顯微注射將重組載體與Marker質粒pRF4共注射到秀麗隱桿線蟲性腺,結果發(fā)現(xiàn)重組載體Pact-EGFP中Act-1基因的核心啟動子能夠指導EGFP在秀麗隱桿線蟲的皮層、副皮層以及咽部表達。利用脂質體介導轉染Vero細胞,發(fā)現(xiàn)重組載體Pact-EGFP和pB-Pact-EGFP-SV40T中的核心啟

7、動子能夠指導EGFP在Vero細胞中表達,但表達強度具有較大的差異,表明秀麗隱桿線蟲Act-1基因的核心啟動子區(qū)域上游以及基因下游的轉錄終止信號區(qū)域可能存在與轉錄水平密切相關的獨特的轉錄調節(jié)元件。該研究為進一步實現(xiàn)寄生性線蟲基因在秀麗隱桿線蟲體內的表達奠定了基礎。3.利用建立的轉基因技術體系,分析H11基因5’側翼區(qū)序列的啟動子轉錄活性
　　 為進一步分析H11基因的5’側翼區(qū)的轉錄活性,在獲得的H11基因組序列的基礎上,再次利

8、用基因步移技術擴增5’上游的部分基因組序列,確認H11基因5,側翼區(qū)大小為1517 bp；同時獲得了H11亞型H11-4最后一個外顯子和3’UTR序列,發(fā)現(xiàn)H11-4基因與H11基因在染色體上不僅是連鎖的,而且具有相同的基因延伸方向。將獲得的5’側翼區(qū)序列單獨或聯(lián)合H11基因的前兩個外顯子、第一內含子以及第二內含子的部分序列克隆到表達載體ppd95.77 GFP基因的上游,顯微注射到線蟲的性腺。結果表明H11基因5’側翼區(qū)序列能夠指導G

9、FP在秀麗隱桿線蟲L4幼蟲和成蟲腸管的前端和末端特異性表達,且顯示出與H11在捻轉血矛線蟲體內不完全相同的表達模式；H11的部分外顯子和內含子序列在秀麗隱桿線蟲體內不能實現(xiàn)正確的剪接,這可能與H11是捻轉血矛線蟲寄生階段特異性表達的蛋白有關。4.利用建立的轉基因技術體系,篩選用于指導H11疫苗候選抗原表達的啟動子序列,并在該啟動子的指導下實現(xiàn)H11基因在秀麗隱桿線蟲體內的表達
　　 選擇秀麗隱桿線蟲體內H11的同系物T07F10

10、.1a基因以及腸道特異性表達的cpr-1和elt-2基因的5’側翼區(qū)序列作為篩選對象,用以在秀麗隱桿線蟲體內表達H11疫苗候選抗原。T07F10.1a、cpr-1和elt-2基因的1885 bp、1985 bp和1998 bp的5’側翼區(qū)序列克隆到表達載體ppd95.77 GFP基因的上游,顯微注射到線蟲的性腺。結果顯示,在T07F10.1a基因的5’側翼區(qū)的轉錄下,GFP能夠在秀麗隱桿線蟲除去胚胎期的整個生命周期中都有表達,表達部位主

11、要集中在秀麗隱桿線蟲的尾部神經元、咽部、分泌細胞、腸道細胞以及神經系統(tǒng)；在cpr-1基因的5’側翼區(qū)的轉錄下,GFP能夠特異性的在線蟲的整個腸道表達,尤其在L4幼蟲和成蟲階段,GFP呈現(xiàn)較高強度的表達；在elt-2基因的5’側翼區(qū)的轉錄下GFP能夠在L3幼蟲到成蟲階段的腸道表達,且呈現(xiàn)明顯的區(qū)段性,即腸道最前端的腸環(huán)1(int1,前腸)、中腸(腸道最中間的部分)以及腸道末端,尤其int1位置的GFP呈現(xiàn)較高強度的表達,但表達強度與部位因

12、蟲體個體不同有較大差異。根據(jù)GFP表達的組織定位、L4幼蟲和成蟲階段GFP的表達強度以及蟲體表達GFP的穩(wěn)定性等差異,最后采用cpr-1的5’側翼區(qū)序列作為在秀麗隱桿線蟲表達H11的啟動子。
　　 在已獲得的重組載體cpr-15’側翼區(qū)∷GFP基礎上,利用特異性引物ppdF/ppdR,在高保真酶作用下,通過長距離PCR擴增切除GFP基因,進行載體自連、環(huán)化,同時在載體上引入SacⅠ、SacⅡ等4個酶切位點構建重組表達載體cpr-

13、pPD95.77(G-)；通過引入EGFP基因對重組載體驗證后,利用SacⅠ和SacⅡ限制性內切酶將基因兩端加有6×His標簽的H11及其部分基因片段Trans-HSP分別引入重組表達載體。cpr-pPD95.77(G-)中cpr-15’側翼區(qū)能夠指導EGFP在秀麗隱桿線蟲的腸道特異性表達表明改造后的重組載體在秀麗隱桿線蟲體內具有表達外源基因的功能。Western-blot分析結果顯示,在cpr-15’側翼區(qū)的啟動下,H11基因在秀麗隱

14、桿線蟲體內沒有明顯表達,而Trans-HPS能夠在秀麗隱桿線蟲體內表達；盡管His單克隆抗體與多克隆抗體能夠檢測到大小一致的特異性目的條帶,利用鎳瓊脂糖凝膠的方法卻未能實現(xiàn)對Trans-HPS的純化,因此,我們選擇Trans-HPS轉基因線蟲的全蟲抗原作為免疫原進行動物免疫保護性試驗。5.利用獲得的轉基因蛋白免疫山羊,比較分析免疫保護效果
　　 采用液體培養(yǎng)的方法大量獲取轉基因表達Trans-HPS蛋白的秀麗隱桿線蟲成蟲,制各全

15、蟲抗原,以250μg/只的劑量免疫山羊,加強免疫一次,用捻轉血矛線蟲L3幼蟲5000條/只的感染強度感染山羊,結合各種指標檢測含有Trans-HPS蛋白的全蟲抗原的免疫保護效果。ELISA檢測結果表明首免后兩周既可檢測到較高的IgG抗體水平,二免后兩周達到高峰,二免后7周抗體水平仍可維持較高水平；外周血淋巴增殖試驗結果顯示,Trans-HSP蛋白能夠顯著增強Trans-HPS蛋白免疫組(p＜0.01)和HPS蛋白免疫組(p＜0.05)淋

16、巴細胞的增殖活性；對不同免疫組山羊排出蟲卵數(shù)、幼蟲孵化率和成蟲數(shù)進行統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)Trans-HPS蛋白免疫組減卵率為41.4％,且能明顯延緩排卵高峰期的到來；Trans-HPS蛋白免疫組成蟲減少率為17.79％,與感染陽性組比較差異不顯著。
　　 綜上,本研究首次獲得了H11的基因組序列,發(fā)現(xiàn)了亞型H11-4與H11之間的基因連鎖現(xiàn)象；建立了以秀麗隱桿線蟲為模式的轉基因技術體系,利用該體系成功實現(xiàn)了H11部分基因片段Trans