1、研究背景和目的:
　　 人類主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ相關(guān)基因A(MICA)在固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用。越來(lái)越多的臨床研究表明，腎移植受者血清中抗MICA抗體的含量與移植后急性和慢性排斥反應(yīng)發(fā)生率密切相關(guān)，但目前其激活和作用機(jī)制仍不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注（I/R）損傷可以上調(diào)小鼠腎臟中MICA表達(dá)，而低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)表達(dá)增加作為缺血早期首發(fā)的分子水平適應(yīng)性反應(yīng)，能通過(guò)調(diào)控下游系列基因表達(dá)，介導(dǎo)與缺氧相關(guān)

2、的各種生理性反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)人原代心肌細(xì)胞中，HIF-1α過(guò)表達(dá)能上調(diào)MICA表達(dá)。因此推測(cè)人腎小管上皮細(xì)胞也可能存在類似激活作用機(jī)制。因此，本研究的目的在于初步探討人腎小管上皮細(xì)胞中HIF-1α過(guò)表達(dá)是否可增強(qiáng)細(xì)胞MICA基因表達(dá)。
　　 方法:
　　 1.進(jìn)行腎小管上皮細(xì)胞系培養(yǎng)，摸索建立體外缺血再灌注模型，確定在2％氧濃度下缺氧18h后正常供氧。
　　 2.進(jìn)行重組腺病毒的擴(kuò)增、純化，采用組織培養(yǎng)感染劑量法

3、(tissuecultureinfectionsdose，TCID法)進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定。
　　 3.轉(zhuǎn)染在常氧下可以穩(wěn)定表達(dá)并發(fā)揮正常功能的HIF-1α重組腺病毒(Ad.CMV.HIF-1α△ODD)，在轉(zhuǎn)染的24、28、72、96h后用TRIZOL提取HK-2的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以B-ACTIN作為內(nèi)參因，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)HIF-1α、HO-1、VEGF和MICA的基因轉(zhuǎn)錄水平。在腺病毒轉(zhuǎn)染的

4、96h用免疫熒光的方法檢測(cè)目的基因HIF-1α在HK-2中蛋白水平的表達(dá)情況。
　　 4.體外用缺氧再給氧（H/R）模型模擬I/R，HIF-1α基因沉默后，將經(jīng)過(guò)RNAi處理過(guò)的細(xì)胞在2％氧濃度下培養(yǎng)18h進(jìn)行缺氧后，在缺氧再給氧的0h、4h、8h和16h收集細(xì)胞。用TRIZOL法提取HK-2細(xì)胞的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。同時(shí)以基因β-ACTIN作為內(nèi)參，通過(guò)熒光定量的方法檢測(cè)HIF-1α和MICA基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　

5、　 5.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±S)來(lái)表示。兩組均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)，使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行計(jì)算，P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.在常氧條件下，HIF-1α的過(guò)表達(dá)可以上調(diào)細(xì)胞MICA基因蛋白的表達(dá)。Ad.CMV.HIF-1α△ODD組和Ad.CMV.HIF-1α組的HIF-1αmRNA水平從轉(zhuǎn)染的24h后就開始升高，在72h達(dá)到高峰，96h有略微的下降;并且兩組間mRNA

6、水平差異不大，在HIF-1α基因的轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)相似。而Ad.CMV.LacZ組和非轉(zhuǎn)基因組的HIF-1αmRNA水平相比前兩組一直保持很低水平，并且基本無(wú)變化。免疫熒光結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染的96h后，Ad.CMV.HIF-1α△ODD組的HIF-1α蛋白的表達(dá)較正常組顯著增加，而Ad.CMV.HIF-1α組中僅檢測(cè)到少量HIF-1α的表達(dá);而Ad.CMV.LacZ組和非轉(zhuǎn)基因組中均未檢測(cè)到HIF-1α蛋白的表達(dá)，提示在常氧狀態(tài)下，改造后的

7、HIF-1α△ODD較HIF-1α的蛋白表達(dá)更為穩(wěn)定，不受氧依賴性的降解。
　　 2.常氧狀態(tài)下，Ad.CMV.LacZ組合和非轉(zhuǎn)基因的MICAmRNA水平一直基本無(wú)變化，提示一般的腺病毒感染不會(huì)啟動(dòng)MICA基因的轉(zhuǎn)錄，而Ad.CMV.HIF-1α△ODD組的MICAmRNA水平在轉(zhuǎn)染后的48h較前兩組有明顯的升高，并在96h達(dá)到對(duì)照組的三倍。Ad.CMV.HIF-1α組的MICAmRNA水平在轉(zhuǎn)染后的72h較對(duì)照組有明顯升高，

8、大約是對(duì)照組的兩倍，但一直明顯低于Ad.CMV.HIF-1α△ODD組。提示常氧狀態(tài)下，HIF-1α的表達(dá)可以上調(diào)MICA基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 3.在缺氧再給氧的0h時(shí)，缺氧組的HK-2細(xì)胞中HIF-1αmRNA的轉(zhuǎn)錄水平相比正常條件下培養(yǎng)的對(duì)照組上調(diào)明顯，并在4h時(shí)持續(xù)升高，在在8h開始下降，16h后即恢復(fù)至正常培養(yǎng)條件下的對(duì)照組水平。而在HIF-1αsiRNA處理組中，0-16h內(nèi)HIF-1α的mRNA表達(dá)水平和對(duì)照組一直

9、沒(méi)有明顯的變化和差異，說(shuō)明對(duì)HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平的沉默抑制效果明顯;并且陰性對(duì)照siRNA處理組中的HIF-1αmRNA的變化情況同缺氧組基本一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)染siRNA本身不能抑制HIF-1αmRNA的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。免疫熒光的結(jié)果也顯示，在缺氧再給氧的0h時(shí)，在缺氧組和陰性siRNA處理組中檢測(cè)到明顯的HIF-1α蛋白表達(dá)，而HIF-1αsiRNA處理組和正常培養(yǎng)條件下的對(duì)照組中則幾乎檢測(cè)不到HIF-1α蛋白的表達(dá)。
　　 4.在缺氧

10、再給氧的0h時(shí)，缺氧組的HK-2細(xì)胞中MICAmRNA的轉(zhuǎn)錄水平相比正常條件下培養(yǎng)的對(duì)照組上調(diào)明顯，并在4h時(shí)持續(xù)升高，在8h開始下降，16h后即恢復(fù)至正常培養(yǎng)條件下的對(duì)照組水平，該表達(dá)變化趨勢(shì)和HIF-1α基因基本一致。而在HIF-1αsiRNA處理組中，0-16h內(nèi)MICA的mRNA表達(dá)水平和正常條件下培養(yǎng)的對(duì)照組一直沒(méi)有明顯的變化和差異，說(shuō)明缺氧再給氧過(guò)程中對(duì)HIF-1α基因的抑制明顯導(dǎo)致了MICA轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào);另一方面，因?yàn)殛?/p>