1、研究目的:
　　乳腺癌已經(jīng)成為威脅女性身體健康的常見惡性腫瘤之一。近些年來，在全世界范圍內(nèi)，乳腺癌在導(dǎo)致女性死亡的惡性腫瘤中已經(jīng)躍居第二位。我國的流行病與統(tǒng)計(jì)學(xué)研究顯示，乳腺癌的發(fā)病率與死亡率正在逐年增長。在2015年，我國大約有4，000，000女性被診斷為乳腺癌，約2，000，000女性因乳腺癌而死亡。乳腺癌的綜合性治療方案包括外科手術(shù)治療，化學(xué)治療，放射治療，內(nèi)分泌治療，靶向藥物治療以及其他輔助性治療。中醫(yī)藥作為乳腺癌輔助性

2、治療中的重要方案，已經(jīng)受到越來越多的重視。頭花千金藤堿是一種具有抗癌作用的中藥，前期研究發(fā)現(xiàn)該藥物具有多種對抗腫瘤的功效。但其在乳腺癌中的抗腫瘤作用機(jī)制并不明確。本文通過應(yīng)用分子生物學(xué)基礎(chǔ)技術(shù)研究，探討中藥頭花千金藤堿在乳腺癌中的作用機(jī)制，為乳腺癌患者尋求新的治療方案提供重要的理論依據(jù)。
　　研究方法及結(jié)果
　　在本課題中，我們對頭花千金藤堿在乳腺癌中的作用機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)的研究，具體研究內(nèi)容包括以下兩部分:
　　第一部

3、分頭花千金藤堿誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬、凋亡和細(xì)胞周期阻滯
　　研究方法:為了檢測頭花千金藤堿對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，我們使用MTT，平板克隆形成，體外劃痕實(shí)驗(yàn)，侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證。我們進(jìn)行了進(jìn)一步的研究來詳細(xì)了解頭花千金藤堿抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的具體作用機(jī)制。為了檢測其對乳腺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期G0/G1期阻滯的影響，我們使用流式細(xì)胞檢測術(shù)及蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證;通過吖啶橙熒光染色，MTT及流式細(xì)胞檢測技術(shù)檢測其對乳腺癌

4、細(xì)胞自噬的影響;接著，我們通過載體構(gòu)建以及蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證頭花千金藤堿作用后AKT/mTOR信號通路的變化。
　　研究結(jié)果: MTT，平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示頭花千金藤堿能夠顯著抑制乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞的增殖;體外劃痕，侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了頭花千金藤堿能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動性;流式細(xì)胞檢測術(shù)及蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測顯示頭花千金藤堿能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡細(xì)胞周期G0/G1期阻滯;通過吖啶橙染色，

5、流式細(xì)胞檢測術(shù)，蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)及MTT實(shí)驗(yàn)檢測顯示頭花千金藤堿能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬;接下來，我們在體外對乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，構(gòu)建AKT（pCDNA3.1-AKT）過表達(dá)細(xì)胞，再利用流式細(xì)胞檢測術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測結(jié)果顯示頭花千金藤堿通過調(diào)控AKT/mTOR信號通路進(jìn)而對乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮抑制作用。
　　第二部分頭花千金藤堿逆轉(zhuǎn)乳腺癌內(nèi)分泌耐藥的機(jī)制研究
　　研究方法:經(jīng)過1年時(shí)間的研究及培育，我們團(tuán)隊(duì)在體外使用

6、他莫昔芬(10μM)誘導(dǎo)培養(yǎng)出MCF-7耐他莫昔芬的耐藥細(xì)胞株（M7-TR）。通過MTT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證他莫昔芬耐藥細(xì)胞系(M7-TR)及親代MCF-7對他莫昔芬的敏感性;利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測M7-TR的侵襲和遷移能力;通過qRT-PCR及蛋白質(zhì)免疫印記實(shí)驗(yàn)檢測M7-TR細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)記物的改變。接著，我們使用MTT檢測頭花千金藤堿對M7-TR耐藥株的抑制作用;體外劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)被用來檢測頭花千金藤堿對M7-TR耐藥

7、株侵襲和遷移能力的抑制作用;接著，通過qRT-PCR及蛋白質(zhì)免疫印記實(shí)驗(yàn)檢測頭花千金藤堿作用于M7-TR細(xì)胞后EMT相關(guān)標(biāo)記物的改變;接下來，我們在M7-TR細(xì)胞中進(jìn)行了P65-siRNA轉(zhuǎn)染，再通過MTT，蛋白質(zhì)免疫印記實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測頭花千金藤堿作用后M7-TR細(xì)胞中NF-κB信號通路及遷移能力的改變。
　　研究結(jié)果:MTT檢測結(jié)果顯示，相較于親代MCF-7細(xì)胞，M7-TR細(xì)胞對他莫昔芬的敏感性降低;Trans

8、well實(shí)驗(yàn)顯示M7-TR的侵襲和遷移能力增強(qiáng);同時(shí)，細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，qRT-PCR及蛋白質(zhì)免疫印記實(shí)驗(yàn)檢測均提示M7-TR細(xì)胞發(fā)生了明顯的EMT樣改變;MTT實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示頭花千金藤堿對M7-TR有顯著的抑制作用;體外劃痕，Transwell實(shí)驗(yàn)顯示頭花千金藤堿對M7-TR細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯抑制;qRT-PCR及蛋白質(zhì)免疫印記實(shí)驗(yàn)顯示頭花千金藤堿能逆轉(zhuǎn)M7-TR細(xì)胞EMT改變;通過對M7-TR細(xì)胞進(jìn)行P65-siRNA轉(zhuǎn)染，通

9、過MTT，蛋白質(zhì)免疫印記實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)顯示頭花千金藤堿通過調(diào)控NF-κB通路抑制M7-TR細(xì)胞的侵襲和遷移。
　　結(jié)論:
　　1.頭花千金藤堿可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡、自噬及細(xì)胞周期G0/G1期阻滯;
　　2.頭花千金藤堿通過調(diào)控AKT/mTOR信號通路，進(jìn)而對乳腺癌細(xì)胞發(fā)揮抑制作用;
　　3.頭花千金藤堿通過抑制乳腺癌內(nèi)分泌耐藥細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而對乳腺癌內(nèi)分泌耐藥引起的浸潤轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用;<