1、同種異體腎移植是終末期腎臟疾病(end stage renal disease,ESRD)最有效的替代治療方式。移植腎急性排斥反應(yīng)(acute renal allograft rejection,AR)是影響腎移植預(yù)后的重要因素,同時(shí)也是器官移植研究的熱點(diǎn)。ABO血型系統(tǒng)屬于人類主要組織相容性抗原系統(tǒng)(human major histocompatibility antigen systems,MHC)。ABO血型同型移植是目前公認(rèn)的安

2、全的器官選擇方式,同時(shí)也是器官移植的基本技術(shù)規(guī)范,從理論到移植免疫的臨床應(yīng)用均很成熟。但是近年來有分散的文獻(xiàn)報(bào)道ABO血型系統(tǒng)似乎是可以逾越的免疫障礙。因?yàn)檫@些文獻(xiàn)沒有充分闡述供受者ABO血型基因結(jié)構(gòu)差異,所以未能被器官移植學(xué)界廣泛接受。目前器官移植采用血清學(xué)方法鑒定ABO血型,近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用到ABO血型研究領(lǐng)域,使得精確檢測(cè)ABO血型基因結(jié)構(gòu)成為可能。
　　 ABO血型基因位于人類第9號(hào)

3、染色體短臂34.1-34.2區(qū)域,有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。ABO血型基因的堿基序列高度保守,ABO血型等位基因間僅有少數(shù)幾個(gè)堿基差異。常見的A血型基因有A1血型等位基因和A2血型等位基因。A1血型等位基因和B血型基因之間僅有7個(gè)核苷酸差異,其中4個(gè)核苷酸差異導(dǎo)致血型基因轉(zhuǎn)錄翻譯合成的氨基酸發(fā)生改變。A2血型等位基因與A1血型等位基因序列存在1個(gè)核苷酸差異(467C>T),同時(shí)缺失1061位點(diǎn)的胞嘧啶(C)。O血型基因中最常見的血型等位

4、基因是O1血型等位基因,其次是O2血型等位基因。O1血型等位基因與A1血型等位基因相比,O1血型等位基因缺失261位點(diǎn)的鳥嘌呤(G)。O2血型等位基因較為少見,與A1血型等位基因相比較,O2血型等位基因在261位點(diǎn)無鳥嘌呤(G)缺失,卻存在3個(gè)核苷酸差異。
　　 ABO血型基因轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶,這些糖基轉(zhuǎn)移酶控制ABO血型抗原的生物合成。H轉(zhuǎn)移酶催化糖蛋白前體物質(zhì)末端半乳糖連接L-巖藻糖,從而產(chǎn)生H抗原。A血型和B血型人群

5、分別表達(dá)UDP-N-乙酰-D-半乳糖胺(A轉(zhuǎn)移酶)和UDP-D-半乳糖(B轉(zhuǎn)移酶),所以能夠?qū)-乙酰半乳糖和半乳糖分別添加到H抗原的巖藻糖末端,產(chǎn)生A血型抗原和B血型抗原。AB血型人群同時(shí)表達(dá)UDP-N-乙酰-D-半乳糖胺(A轉(zhuǎn)移酶)和UDP-D-半乳糖(B轉(zhuǎn)移酶),因此AB型紅細(xì)胞表面同時(shí)表達(dá)A血型抗原和B血型抗原。O血型人群既不表達(dá)A轉(zhuǎn)移酶也不表達(dá)B轉(zhuǎn)移酶,故既不能合成A血型抗原,也不能合成B血型抗原。所以O(shè)血型人群紅細(xì)胞表面僅表

6、達(dá)H抗原物質(zhì)。ABO血型基因位點(diǎn)突變可導(dǎo)致ABO血型基因轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)氨基酸的模板序列產(chǎn)生差異,使得ABO血型等位基因產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)、活性及功能發(fā)生改變,從而產(chǎn)生ABO血型亞型。目前發(fā)現(xiàn)的A血型亞型有A1、A2、A3、Aw、Ax、Am&Ael等50余種,B血型亞型包括B3(B301-306),Bw,Bel,Bx等40余種,O血型亞型包括O1,O2等50余種。ABO血型中,最常見的A血型亞型是A1、A2亞型,在歐洲人種中A1亞型約占8

7、0％,A2亞型約占20％,A2亞型中1～2％個(gè)體血清中可檢測(cè)到抗A1抗體；最常見的O血型亞型是O1、O2亞型；目前關(guān)于B亞型的研究較少,本研究未對(duì)B型進(jìn)行分型。
　　 常規(guī)應(yīng)用血清學(xué)方法(正定和反定)鑒定ABO血型,但在鑒定ABO血型亞型及異常表達(dá)的個(gè)體時(shí)受到限制,而檢測(cè)血型基因可精確分辨ABO血型亞型。目前檢測(cè)ABO血型基因的常見方法有PCR-限制性內(nèi)切酶酶切法(PCR-RFLP,polymerase chain reacti

8、on-restriction fragment length polymorphism)、引物特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR-SSP,PCR amplification with sequence-specific primers)和PCR-DNA等檢測(cè)技術(shù)。PCR-SSP檢測(cè)ABO血型等位基因,是利用ABO血型等位基因位點(diǎn)特定堿基的差異設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物序列,設(shè)計(jì)合成的引物特異擴(kuò)增目的基因。
　　 綜上所述,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)

9、展,人類在ABO血型抗原、抗體、糖基轉(zhuǎn)移酶、ABO血型基因各個(gè)層次的研究不斷深入,所以我們認(rèn)為有必要重新審視ABO血型這一經(jīng)典問題在移植排斥中的意義,明確供受者ABO血型基因錯(cuò)配是否可導(dǎo)致移植術(shù)后排斥反應(yīng)。本研究采用引物特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR-SSP)技術(shù)檢測(cè)87例腎移植受者及其對(duì)應(yīng)48例供者的ABO血型基因,并探討供受者ABO血型基因與移植腎急性排斥反應(yīng)的相關(guān)性。本論文可分為以下兩章。
　　 第一章、PCR-SSP方法檢

10、測(cè)ABO血型基因的可行性分析
　　 目的:探討應(yīng)用引物特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR-SSP)技術(shù)檢測(cè)同種異體腎移植供受者ABO血型基因的可行性。
　　 方法:采用PCR-SSP技術(shù)檢測(cè)2009年5月至2010年2月在我院行同種異體腎移植手術(shù)的87例腎移植受者及其對(duì)應(yīng)的48例供者的ABO(A1、A2、B、O1、O2)血型基因。同時(shí)采用血清學(xué)方法確定其相應(yīng)的血清學(xué)表型。
　　 結(jié)果:應(yīng)用PCR-SSP方法在本組135

11、個(gè)病例中檢測(cè)到13種ABO血型基因型,其中A1A1血型基因型2例、A1O1血型基因型14例、A1O2血型基因型5例、A2O1血型基因型1例、A2O2血型基因型1例、BB血型基因型5例、BO1血型基因型14例、BO2血型基因型7例、O1O1血型基因型22例、O1O2血型基因型41例、O2O2血型基因型9例、A1B血型基因型12例、A2B血型基因型2例,未檢測(cè)到A1A2、A2A2血型基因型。血清學(xué)方法和PCR-SSP方法確定的ABO血型表型

12、中,有A型23例,B型26例,O型72例,AB型14例。引物特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR-SSP)方法和血清學(xué)方法確定的ABO血型表型完全一致。
　　 結(jié)論:本研究應(yīng)用PCR—SSP方法和血清學(xué)方法所定ABO血型表型完全相符,提示本研究ABO血型等位基因引物設(shè)計(jì)合成可靠,引物擴(kuò)增條件穩(wěn)定。因?yàn)镻CR-SSP方法檢測(cè)ABO血型基因與HLA檢測(cè)共享技術(shù)平臺(tái),且具有簡(jiǎn)捷、易操作、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn),所以檢測(cè)供受者HLA時(shí)同步檢測(cè)供受者AB

13、O血型基因具有很強(qiáng)的可行性。
　　 第二章、ABO血型基因與移植腎急性排斥反應(yīng)的關(guān)系
　　 目的:探討供受者ABO血型基因與受者移植腎急性排斥反應(yīng)(AR)的發(fā)生、治療及轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。
　　 方法:PCR-SSP方法檢測(cè)2009年5月至2010年2月在我院行同種異體腎移植手術(shù)的87例腎移植受者及其對(duì)應(yīng)的48例供者的ABO(A1、A2、B、O1、O2)血型基因,將受者分為供受者ABO血型基因相合組、供受者ABO血型基因

14、錯(cuò)配組,分析供受者ABO血型基因相合組與錯(cuò)配組受者移植腎急性排斥反應(yīng)的發(fā)生、治療及轉(zhuǎn)歸情況。
　　 結(jié)果:本研究135例供受者中,供受者ABO血型基因相合組受者50例(占57.5％),供受者ABO血型基因錯(cuò)配組受者37例(占42.5％)。供受者ABO血型基因相合組6例(占12.0％)受者發(fā)生移植腎急性排斥反應(yīng),ABO血型基因錯(cuò)配組11例(占29.7％)受者發(fā)生移植腎急性排斥反應(yīng)。供受者ABO血型基因相合組與錯(cuò)配組受者間移植腎急性

15、排斥反應(yīng)發(fā)生率(12.0％VS29.7％,P=0.039<0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)大劑量甲基強(qiáng)的松龍(MP)沖擊治療后,ABO血型基因相合組發(fā)生移植腎急性排斥反應(yīng)的受者均臨床逆轉(zhuǎn),移植腎功能恢復(fù)正常；ABO血型基因錯(cuò)配組發(fā)生移植腎急性排斥反應(yīng)的受者,經(jīng)甲基強(qiáng)的松龍(MP)沖擊治療后,10例受者臨床逆轉(zhuǎn),1例受者周期性反復(fù)發(fā)生移植腎急性排斥反應(yīng)。該受者同種異體腎移植術(shù)后3～10月間反復(fù)發(fā)生4次移植腎急性排斥反應(yīng),經(jīng)大劑量甲基強(qiáng)的松龍

16、(MP)沖擊治療有效,但甲基強(qiáng)的松龍治療效果逐漸降低,術(shù)后1年血清肌酐(Scr)達(dá)441μmol/L。供者和受者ABO血型基因分別為A1O1:A2O1,檢測(cè)受者ABO血型同種抗體,患者血清中存在抗A1抗體,抗A1抗體效價(jià)IgG1:64,IgM1:16；隨訪復(fù)查患者血清群體反應(yīng)性抗體(panel reactiveantibodies,PRA)陰性,自身免疫抗體陰性,他克莫司(FK506)血藥濃度波動(dòng)于7～10 ng/ml,行移植腎動(dòng)脈造影

17、提示腎動(dòng)脈未見明顯異常。ABO血型基因相合組和錯(cuò)配組受者移植腎恢復(fù)時(shí)間(8.7±6.5 VS7.6±4.9,P=0.105>0.05)、術(shù)后1個(gè)月血清肌酐(124.1±40.6 VS122.54±39.4,P=0.849>0.05)、術(shù)后6個(gè)月血清肌酐(109.7±27.9 VS118.8±47.6,P=0.532>0.05)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:供受者ABO血型基因錯(cuò)配組受者移植腎急性排斥發(fā)生率較ABO血型基因相合組

18、受者的移植腎急性排斥發(fā)生率高。供受者ABO血型基因錯(cuò)配是導(dǎo)致腎移植受者發(fā)生移植腎急性排斥的危險(xiǎn)因素。供受者ABO血型基因錯(cuò)配導(dǎo)致移植腎急性排斥的機(jī)制可能是通過ABO血型基因表達(dá)抗原誘發(fā)免疫反應(yīng)引起移植腎急性排斥,也可能與供受者ABO血型基因錯(cuò)配直接相關(guān)。A2血型等位基因腎移植受者血清中抗A1抗體可導(dǎo)致A1表型供腎反復(fù)發(fā)生移植腎急性排斥并引起移植腎預(yù)后不良。臨床實(shí)踐中,A2血型等位基因受者接受O型供腎可提高移植的安全性。檢測(cè)供受者ABO血