1、目的：
　　 觀察抗生素及益生菌在幽門(mén)螺桿菌感染BALB/c小鼠IFN-γ及IL-17活性及對(duì)機(jī)體Th17/Th1平衡的影響，探索益生菌對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染BALB/c小鼠的保護(hù)機(jī)制。
　　 方法：
　　 復(fù)活凍存幽門(mén)螺桿菌菌株于培養(yǎng)基中微需氧、37℃條件下培養(yǎng)72小時(shí)，取菌落行革蘭氏染色及Giemsa染色，經(jīng)光鏡下觀察、觸酶、氧化酶及尿素酶測(cè)試后判定是否為幽門(mén)螺桿菌生長(zhǎng)。選用清潔級(jí)6周齡BALB/c小鼠50只（由中

2、國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌雄各半，體質(zhì)量（20±1g），隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組44只（新鮮HP菌懸液灌胃，1×109CFU/mL，0.5mL/只），對(duì)照組6只（生理鹽水灌胃，0.5ml/只），1次/日，連續(xù)7天。所有小鼠平時(shí)不限制飲食及飲水，實(shí)驗(yàn)組灌胃前8小時(shí)予禁食，灌胃后禁食4小時(shí)。隨機(jī)取材證實(shí)造模成功后予實(shí)驗(yàn)組三聯(lián)抗生素、益生菌及聯(lián)合用藥干預(yù)，藥物濃度分別為克拉霉素50mg/mL，奧美拉唑1mg/mL，阿莫西林75 mg/

3、mL，布拉氏酵母菌50mg/mL。每天給藥1次，共2周，末次治療后4周時(shí)禁食24h小鼠后腹腔注射10％水合氯醛麻醉，剖腹后腹主動(dòng)脈采血及無(wú)菌取出全胃。采血后離心收集上清用于ELISA檢測(cè)，胃組織用4％多聚甲醛固定12～16 h留取組織標(biāo)本，進(jìn)行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察組織大體改變，Giemsa染色觀察幽門(mén)螺桿菌定植情況。
　　 免疫組化染色及結(jié)果判定方法:采用免疫組化二步法檢測(cè)模型組、抗生素組、益生菌組及聯(lián)合用藥組中IFN-

4、γ及IL-17的表達(dá)。IFN-γ兔抗鼠一抗購(gòu)自北京博奧森生物有限公司，工作濃度:1∶300。IL-17兔抗鼠一抗購(gòu)自北京博奧森生物有限公司，工作濃度:1∶200。鼠抗兔二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。結(jié)果判定:IFN-γ和IL-17在細(xì)胞漿或細(xì)胞膜中呈現(xiàn)清晰棕黃色特異性免疫反應(yīng)顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。每組取6張組化染色片（陽(yáng)性者表現(xiàn)為胞質(zhì)或胞核棕黃色顆粒），在每張切片上隨機(jī)選取5個(gè)視野照相，采

5、用人工計(jì)數(shù)法分析免疫組化陽(yáng)性得分。
　　 ELISA測(cè)定及結(jié)果判定方法:采血使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清用于ELISA檢測(cè)。應(yīng)用雙抗體夾心法，依次進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和加樣、待測(cè)樣本加樣、37℃溫育、洗滌、加辣根過(guò)氧化物酶、37℃溫育、洗滌、顯色、終止液終止顯色、加終止液后15min內(nèi)在450nm波長(zhǎng)處依次測(cè)定各孔的吸光度（OD值），并繪制標(biāo)準(zhǔn)

6、曲線，由曲線方程計(jì)算各樣本濃度值，再乘以稀釋倍數(shù)。應(yīng)用單因素方差分析(one-way ANOVA)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 復(fù)活凍存幽門(mén)螺桿菌菌株于培養(yǎng)基中微需氧、37℃條件下培養(yǎng)72小時(shí)可見(jiàn)菌落呈灰白色半透明狀，取少許菌落，經(jīng)革蘭氏及Giemsa染色后可鑒定為幽門(mén)螺桿菌生長(zhǎng)。灌胃及用藥后表現(xiàn):幽門(mén)螺桿菌造模組灌胃期間出現(xiàn)進(jìn)食水差，腹瀉，皮毛蓬松無(wú)光澤，體重下降，活動(dòng)少

7、，抖動(dòng)，走路不穩(wěn)，對(duì)外界聲音刺激反應(yīng)能力明顯下降。灌胃結(jié)束1周后體重恢復(fù)緩慢，藥物干預(yù)后，抗生素組、益生菌組及聯(lián)合用藥組小鼠活動(dòng)量增加，皮毛恢復(fù)光澤，腹瀉好轉(zhuǎn)，進(jìn)食恢復(fù)正常，癥狀、體征逐漸消失，體重增長(zhǎng)良好。
　　 病理改變:HE染色后光鏡下幽門(mén)螺桿菌造模組有不同程度的炎癥表現(xiàn)如淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等改變，干預(yù)治療后炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，黏膜完整連續(xù)。
　　 免疫組化:模型組小鼠胃黏膜可見(jiàn)大量棕黃色I(xiàn)FN-γ及IL-

8、17顆粒沉積于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜，表達(dá)強(qiáng)于其余各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)?？股亟M及益生菌組呈陽(yáng)性或弱陽(yáng)性表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。聯(lián)合治療組呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)，明顯弱于其余各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。空白對(duì)照組表達(dá)強(qiáng)弱不等，考慮與應(yīng)激等因素有關(guān)。
　　 ELISA測(cè)定IFN-γ及IL-17表達(dá):模型組IFN-γ，IL-17表達(dá)顯著高于其余各組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？股亟M及益生菌

9、表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。聯(lián)合治療組表達(dá)量顯著低于其余各組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。空白對(duì)照組表達(dá)偏高，考慮與應(yīng)激等因素有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 IFN-γ及IL-17在幽門(mén)螺桿菌感染小鼠中陽(yáng)性表達(dá)率較高，提示二者可能協(xié)同參加了HP誘導(dǎo)的機(jī)體炎癥反應(yīng)，并造成黏膜炎癥損傷，與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。經(jīng)聯(lián)抗生素及益生菌干預(yù)后，Th1主要代表者IFN-γ及Th17代表者IL-17明顯降低(P＜0.05

10、)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示藥物干預(yù)可以降低機(jī)體內(nèi)Th17/Th1反應(yīng)，減少體內(nèi)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎癥恢復(fù)?？股馗深A(yù)及益生菌干預(yù)后IFN-γ及IL-17相比較P均＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示本實(shí)驗(yàn)中益生菌治療可能與抗生素干預(yù)無(wú)明顯差異，可能與益生菌抑制HP的黏附、分泌某些抗細(xì)菌黏附的活性物質(zhì)并與HP競(jìng)爭(zhēng)黏附于胃黏膜結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)。聯(lián)合用藥組IFN-γ及Th17明顯降低，提示聯(lián)合應(yīng)用抗生素及益生菌治療可能對(duì)機(jī)體清除幽門(mén)螺桿菌、減輕炎癥反應(yīng)