1、研究背景:幽門螺桿菌(Helicobacter priori,H pylori)是一種有鞭毛的螺旋狀的革蘭染色陰性微需氧彎曲細(xì)菌。1983年澳大利亞學(xué)者Warren和Marshall首次從慢性活動性胃炎患者的胃竇黏膜活檢組織中分離出H.prlori。近二十年以來,H.pylori作為人類感染率最高的致病性細(xì)菌之一,引起學(xué)術(shù)界極大的關(guān)注。近年Krajden和Fcrguson分別從牙菌斑和唾液中分離和培養(yǎng)出H.pylori,口腔H.pylo

2、ri成為一大熱點(diǎn)。其研究內(nèi)容包括:其一,使用PCR,分離培養(yǎng)法或尿素酶試驗(yàn)法等多種方法從口腔牙菌斑、唾液、黏膜組織、嘔吐物中檢測到H.pylori。其二,研究顯示口腔H.pylori與多種口腔疾病的發(fā)生有關(guān),包括復(fù)發(fā)性口腔潰瘍、口臭、牙周炎、齲病等。其三,患者口腔H.pylori與胃內(nèi)H.pylori一致,兩者有互相傳播的可能。如Ferguson等通過可溶性蛋白電泳,DNA的限制性內(nèi)切酶分析證實(shí)口腔H.pylori與胃內(nèi)H.pylori

3、同源。其四,部分胃H.pylori再感染者與前次感染同源,其可能是胃內(nèi)H.pylori根除后復(fù)發(fā)原因之一。如有國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)1年后復(fù)發(fā)的患者經(jīng)過隨機(jī)引物PCR證實(shí)與前次感染同源。其五,口腔健康狀態(tài)差或口腔中檢測到H.pylori的患者三聯(lián)療法H.pylori根除率低。其六,還有研究證實(shí)目前的三聯(lián)療法能夠清除胃內(nèi)H.pylori,但不能清除口腔H.pylori。其可能與口腔牙菌斑特殊的“生物膜”有關(guān)。
　　 人類是H.pylor

4、i的自然傳染源,胃是H.priori最主要的寄居地,為學(xué)術(shù)界所公認(rèn)?？谇籋.pylori的分離和培養(yǎng)提示,口腔是H.pylori的另一聚集地。第一,H.pylori作為口腔眾多微生物中的一種,影響整個或局部口腔微生態(tài),可促進(jìn)某些口腔疾病的發(fā)生和發(fā)展。第二,口腔H.pylori可能是胃內(nèi)H.pylori感染和復(fù)發(fā)的重要因素,因而,抑制口腔H.pylori可使口腔和胃都有獲益。鑒于H.pylori對抗生素耐藥性的增加,以及口服抗生素對口腔H

5、.pylori清除效果不理想,使之清除口腔H.pylori不同于傳統(tǒng)的胃H.pylori根除的三聯(lián)療法。我國具有豐富的中醫(yī)藥資源,是人們生活醫(yī)療保健必不可少的一部分,中藥具有取材容易、價格便宜、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)勢,是新藥開發(fā)的重要原料。因此,本文試圖從多種以清熱解毒為主的常用中藥中篩選并組合成基礎(chǔ)配方,它具有較強(qiáng)抗H.pylori活性,起到抑菌消炎和維護(hù)口腔微生態(tài)平衡的作用；同時在中醫(yī)上具有止血、緩解疼痛等多種綜合功效,可防

6、治細(xì)菌引起的牙齦炎及由其發(fā)展的牙周疾病,為研制抑制口腔H.pylori的生長的口腔護(hù)理產(chǎn)品如牙膏、含片等提供理論基礎(chǔ)。再者,口腔局部使用配合三聯(lián)療法根除H.pylori,完善目前的防治方法,從而降低胃H.pylori的感染率及復(fù)發(fā)率。
　　 本課題由三部分實(shí)驗(yàn)構(gòu)成:第一部分,從在校大學(xué)生口腔分離培養(yǎng)H.pylori并分析其與牙齦炎的相關(guān)性,測試口腔H.pylori分離株對七種常用抗生素藥物敏感性。第二部分,測試50種中藥抗H.p

7、ylori標(biāo)準(zhǔn)株體外活性強(qiáng)度,并討論幾種具有強(qiáng)抗H.pylori活性中藥的藥性、歸經(jīng)、功效等。第三部分,篩選一組具有強(qiáng)抗H.pylori活性的中藥組方,具有更強(qiáng)抗菌抗炎的作用,可局部用于口腔抑制H.pylori生長及口腔衛(wèi)生保健。
　　 第一部分:調(diào)查大學(xué)生口腔幽門螺桿菌與牙齦炎的相關(guān)性及其抗生素的藥物敏感性
　　 目的
　　 1.調(diào)查一般人群口腔H.pylori的感染率。
　　 2.分析口腔H.pylo

8、ri與牙齦炎的相關(guān)性。
　　 3.測試口腔H.pylori分離株對甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、呋喃唑酮、左氧氟沙星、慶大霉素和紅霉素等7種常用抗生素的耐藥性。
　　 方法
　　 1.研究人群:佛山科技學(xué)院的在校大學(xué)生,年齡18～25歲,均獲得知情同意。
　　 (1)問卷檢查排除以下:①吸煙；②系統(tǒng)性疾病,如糖尿病、出血性疾病、上呼吸道感染等；⑨近半年內(nèi)接受過牙周治療、服用過抗生素或非甾體類抗炎藥；④明顯的

9、牙齒松動和嚴(yán)重的牙槽骨吸收、廣泛的齲壞、牙齒錯位。
　　 (2)一般口腔檢查:經(jīng)過有經(jīng)驗(yàn)的臨床牙科醫(yī)生詢問患者主訴、病史、自覺癥狀,依據(jù)患者牙周袋探診深度(PD)、出血指數(shù)(SBI)和牙齦指數(shù)(GI)排除嚴(yán)重的牙周炎癥疾病,牙周炎也被排除。并且將所有受試者分為牙齦炎組和無牙齦炎組。
　　 2.標(biāo)本采集:用無菌刮勺刮取患者兩側(cè)切牙、尖牙、前磨牙、磨牙的齦上、齦下菌斑,并收集1ml的唾液,充分混合。
　　 3.細(xì)菌接

10、種、分離、培養(yǎng)、傳代、鑒定和保存:于微需氧環(huán)境下在選擇性哥倫比亞固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。肉眼觀察菌落,挑取可疑菌落傳代培養(yǎng),涂片,革蘭染色,鏡下觀察菌體形態(tài),尿素酶試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)等生化試驗(yàn)鑒定。菌種保存于改良布氏肉湯甘油液體培養(yǎng)基。
　　 4.統(tǒng)計方法:應(yīng)用分層分析卡方檢驗(yàn)(SPSS13.0)分析牙齦炎與口腔H.pylori陽性率關(guān)系。
　　 5.抗生素敏感試驗(yàn):運(yùn)用K-B紙片法測試臨床口腔H.pylori分離株對

11、7種常用抗生素藥物敏感性,用游標(biāo)卡尺測量每種抗生素的抑菌環(huán)半徑,參照中國藥品生物制品鑒定所制訂的藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)判斷敏感、中度敏感和耐藥。
　　 結(jié)果
　　 1.總計356名在校大學(xué)生接受了此項(xiàng)調(diào)查,其中男生152名,女生204名。診斷表明,總患牙齦炎率為30.9％(110/356)。
　　 2.從受試者多個牙位的牙菌斑口腔唾液共獲取356份混合標(biāo)本。分離培養(yǎng)、鑒定和保存了48(13.5％,48/356)株H.p

12、ylori菌株,患牙齦炎者H.pylori感染率為24.5％(27/110),未患牙齦炎者H.pylori感染率8.5％(21/246)?；佳例l炎者H.pylori感染率顯著高于未患牙齦炎者,x2=16.7,P=0.000(P<0.05)。
　　 3.男生組中,患牙齦炎者H.pylori感染率為20.8％(11/53),未患牙齦炎者H.pylori感染率為7.1％(7/99),患牙齦炎者H.pylori感染率顯著高于未患牙齦炎者

13、,x2=6.192,P=0.013(P<0.05)。
　　 4.女生組中,患牙齦炎者H.pylori感染率為28.1％(16/57),未患牙齦炎者H.pylori感染率為9.5％(14/147),患牙齦炎者H.pylori感染率顯著高于未患牙齦炎者,x2=11.263,P=0.001(P<0.05)。
　　 5.甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、呋喃唑酮、左氧氟沙星、慶大霉素和紅霉素的耐藥率分別是83.3％(40/48),33

14、.3％(16/48),14.6％(7/48),6.3％(3/48),29.2％(14/48),52.1％(25/48),27.1％(13/48)。
　　 結(jié)論
　　 1.口腔是H.pylori的儲存地,在特定的情況下,牙齦炎可能為H.pylori定植于口腔提供了更為適合的微環(huán)境,或者口腔H.pylori的定植可能為牙齦炎發(fā)生的促進(jìn)因素之一。而兩者關(guān)系及作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。
　　 2.口腔H.pylori對甲硝

15、唑、克拉霉素、阿莫西林、呋喃唑酮、左氧氟沙星、慶大霉素和紅霉素都有較高的耐藥性。
　　 第二部分:中藥體外抗幽門螺桿菌活性篩選測試
　　 目的:評估50種常用中草藥體外抗H.pylori活性,篩選出較強(qiáng)活性藥物,為進(jìn)一步臨床應(yīng)用抑殺H.pylori提供初步的理論依據(jù)。
　　 方法:用布氏肉湯倍比稀釋法,測試50種中藥水煎液物體外抗H.pylori悉尼標(biāo)準(zhǔn)株活性,用最小抑菌濃度(MIC)評估活性大小。
　　

16、 結(jié)果:多種中藥水煎液具有較強(qiáng)的體外抗H.pylori活性,其中黃連、黃芩、板藍(lán)根三種水煎液抗H.pylori活性最強(qiáng),最小抑菌濃度均為7.8mg/ml。
　　 結(jié)論:黃連、黃芩、板藍(lán)根三種中藥價格便宜,毒性低,副作用小,不易產(chǎn)生耐藥性,有可能為新藥的合成提供潛在原材料。
　　 第三部分:篩選抑制口腔幽門螺桿菌生長的中藥組方
　　 目的:擬研制一種抗口腔H.pylori的中藥基礎(chǔ)方,可長期局部用于口腔,抑制口腔H

17、.pylori生長和繁殖,維持口腔微生態(tài)環(huán)境平衡,保持口腔健康。
　　 方法:以中藥抗H.pylori最小抑菌濃度為基礎(chǔ),選三種具有強(qiáng)抗H.pylori活性的中藥,并檢測此三種中藥對口腔分離株的MIC50、MIC75和MIC90,以三種藥物作為三個因素,藥物不同濃度為三個水平,采用正交設(shè)計法,進(jìn)行9輪試驗(yàn)測定三種藥物混合液的對口腔分離株抑菌率。
　　 結(jié)果:黃芩、金銀花、蒲公英三種中藥具有強(qiáng)體外抗H.pylori活性,中