1、骨質(zhì)疏松（OP）發(fā)病的病理機制為破骨細胞（OC）骨吸收的速率超過成骨細胞（OB）骨生成能力，從而導致負性骨平衡。人體骨骼持續(xù)不斷地進行更新和重建，從而維持骨的新舊交替、保持骨骼強度的動態(tài)平衡。這一骨重建過程，依賴于OC的骨吸收和 OB的骨形成兩個過程精確協(xié)調(diào)。近年來大量研究已從細胞水平展示了 OC和 OB之間相偶聯(lián)的奇妙關(guān)系，它們經(jīng)細胞內(nèi)外多途徑精確信號調(diào)控，涉及正負反饋環(huán)和雙向作用機制，從而維持骨穩(wěn)態(tài)。外泌小體（exosomes）是由

2、細胞內(nèi)多泡體（multivesicular body。MVB）與細胞膜融合后,釋放到細胞外基質(zhì)中的一種直徑約60-100nm的膜性囊泡，參與細胞間的信息交流及多種生理病理過程。它可由淋巴細胞、間充質(zhì)干細胞、腫瘤細胞等多種細胞所分泌。既往的研究已證明外泌小體在骨髓瘤、骨肉瘤、帕金森病、阿爾茨海默癥、結(jié)直腸癌等疾病方面具有重要作用。目前國內(nèi)外有關(guān)破骨細胞來源外泌小體的研究報道較少，對破骨細胞外泌小體的生物學特性及其在成骨分化方面功能機制的研

3、究可為骨質(zhì)疏松、骨硬化等多種代謝性骨骼疾病的防治提供新的思路及方向。
　　目的：分離鑒定破骨細胞外泌小體（exosomes），觀察破骨細胞外泌小體在成骨前體細胞（kusao細胞）成骨分化中的作用，明確破骨細胞外泌小體是否促進了kusao細胞的成骨分化，尋找破骨細胞外泌小體促進成骨分化的關(guān)鍵因子。
　　方法：
　　1、用RANKL誘導因子對Raw264.7細胞進行破骨誘導，對誘導后的細胞進行TRAP染色鑒定；2、用超濾離

4、心法從破骨細胞上清液中分離破骨細胞外泌小體（OC-exosomes）；3、Western blot檢測外泌小體（exosomes）特征蛋白CD9、CD63的表達并對其進行Nanosight粒度分析；4、觀察PKH67標記的外泌小體靶定受體細胞kusao；5、將kusao細胞分成3組，完全培養(yǎng)基組（CM組），成骨誘導液組（OM組），成骨誘導液+破骨細胞外泌小體組（OME組），隔天換液，培養(yǎng)14天后通過Western blot、茜素紅染色、

5、Von kossa銀染色、q-PCR檢測等，明確破骨細胞外泌小體在kusao細胞成骨分化中的作用；6、運用蛋白組學分析方法分析破骨細胞外泌小體，尋找出關(guān)鍵蛋白并通過Western blot、q-PCR檢測進一步驗證。
　　結(jié)果：
　　1、TRAP染色可見紅色多核、體積大、形狀不規(guī)則的TRAP陽性巨細胞，即為破骨細胞；2、破骨細胞上清液中檢測到大小均一、直徑約為50-200nm的膜性微囊泡結(jié)構(gòu)，經(jīng)Western blot檢測證

6、實其表達外泌小體特征蛋白CD9、CD63，鑒定為破骨細胞外泌小體；3、PKH67標記的破骨細胞外泌小體能靶定受體kusao細胞；4、Western blot檢測結(jié)果顯示OM組RUNX2蛋白的表達量是CM組的1.25倍、OME組的2.72倍。5、茜素紅染色結(jié)果顯示CM組、OM組、OME組的鈣鹽沉積面積占總面積的比值分別為：0.21％、3.47%、20.74%；6、Von kossa銀染色結(jié)果顯示CM組、OM組、OME組的鈣鹽沉積面積占總面

7、積的比值分別為：0.066%、2.64%、20.89%；7、q-PCR結(jié)果分析顯示：①OME組RUNX2的表達量明顯較 OM、CM組少，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；②OME組 SPP1的表達量較OM、CM組少，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；8、蛋白組學分析發(fā)現(xiàn)破骨細胞外泌小體中MMP9的表達量是Raw264.7細胞外泌小體的13.552倍；9、Western blot檢測結(jié)果顯示MMP9蛋白的表達量在OC-exosom

8、e組明顯高于 RC-protein、OC-protein組（P<0.01）；10、q-PCR檢測結(jié)果顯示：成骨誘導14天后，與成骨誘導液組（OM組）相比，成骨誘導液+破骨細胞外泌小體組（OME組）的MMP9基因表達明顯上調(diào)，有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、應用超濾離心法成功從破骨細胞上清液中分離出外泌小體；2、破骨細胞外泌小體具有促進成骨前體細胞（kusao細胞）成骨分化的作用；3、破骨細胞外泌小體中高表